191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
1 2 697 (1967)]. Nemrég közölték, hogy az. inzulin mRNS-ának elsődleges transzlációs terméke nem a prolnzulin maga, hanem egy úgynevezett preproinzulin, amely a proinzulinhoz képest több mint 20 további aminosavat tartalmaz [Cahn, Kein, Steiner, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 73, 1964, 1976, és Lomedico és Saunders, Nucl. Acids Res., 3,381,1976]. A preproinzulin molekulájának szerkezetét röviden a következőképpen írhatjuk le: NH2-(pre-peptid)-B-lánc-(C peptid)-A-lánc-COOH. Számtalan olyan fehérje ismeretes, amelynek gyógyászati vagy kutatási jelentősége van, és amelyeket a magasabbrendű szervezetekben, például gerincesekben találhatunk meg, vagy azok szintetizálják őket. Ilyenek például az inzulin vagy más fehérje hormonok, mint például a növekedési hormon, továbbá a vérnyomás szabályozásában résztvevő fehérjék, ipari, orvosi, vagy kutatási jelentőséggel bíró enzimek. Rendszerint igen nehéz megfelelő mennyiségű ilyen fehérjét előállítani az adott organizmusból például extrakcióval, és ez a nehézség különösen akut módon jelentkezik az emberi eredetű fehérjék esetén. Ezért van szükségünk olyan eljárásokra, amelyek segítségével ezeket a proteineket a magasabbrendű organizmus részvétele nélkül megfelelő mennyiségben rendelkezésre álló más sejtekben állíthatjuk elő. Bizonyos esetekben lehetséges megfelelő mennyiségű sejteket hosszú időn át a szövettenyésztés megfelelő módszereivel fenntartanunk. Azonban a szövettenyészetek sejtjeinek növekedése igen lassú, a táptalaj drága, a tenyésztés körülményeit igen pontosan be kell tartanunk, ugyanakkor a kitermelés alacsony. Ezenfelül gyakran nagyon nehézkes egy olyan adott sejtvonal fenntartása, amely a megkívánt jellemzőkkel rendelkezik. Ezzel szemben a mikroorganizmusok, mint például a baktériumok, viszonylag könnyen növeszthetők kémiailag meghatározott összetételű táptalajon. A fermentációs technológiák igen fejlettek, és jól szabályozhatók. A mikroorganizmusok növeke’ dése gyors és magas kitermelés érhető el. Ezenfelül bizonyos mikroorganizmusok genetikusán jól jellemzettek, más szóval a legjobban jellemzett és legismertebb organizmusok közé tartoznak. A fentiek alapján igen előnyös egy olyan gén bejuttatása egy megfelelő organizmusba, amely orvosilag jelentős fehérjét határoz meg. Ezen a módon az eredetileg magasabbrendű organizmusban szintetizálódó fehérjét nagy mennyiségben állíthatjuk elő szabályozott körülmények között növesztett mikroorganizmusokkal. Ugyancsak lehetséges ily módon a megfelelő protein olcsó előállítása. További előnyt jelent, hogy az adott protein termelését meghatározó genetikai kód izolálásával és átvitelével a jól ismert genetikai háttérrel rendelkező mikroorganizmusba, tanulmányozhatjuk, a protein szintézisének szabályozását és a szintézis utáni sorsát. Ezenkívül az izolált genetikai kód (DNS) szekvenciájának változtatásával előállíthatunk olyan új bázissorrendet, amely különböző, más terápiás vagy funkcionális tulajdonságokkal rendelkező proteineket határoz meg. A találmány szerinti eljárással a fenti célokat elérjük. Az eljárást enzimek által katalizált reakciókat magába foglaló lépések komplex sorozatán át ismertetjük. Az enzimreakciók természetét, amenynyire ezeket az irodalom alapján Ismeijük, részletesen tárgyaljuk. A reverz transzkriptáz az RNS templáttal komplementer DNS szintézisét katalizálja az RNS templát, egy oligo-dezioxi-nukleotid primer és négy dezoxj-nukleozid-trifoszfát, a dATP, dGTP, dCTP és a TTP jelenlétében. A reakció úgy indul, hogy az oligo-dezoxi-nukleotid primer nem-kovalensen kötődik az mRNS molekula 3 -végéhez, majd az mRNS nukleotid-sorrendjének megfelelően lépésenként hozzákapcsolódnak a növekvő lánc 3 -végéhez a megfelelő dezoxi-nukleotidok. Az így létrejövő molekulát hajtű-szerkezetként írhatjuk le, amely tartalmazza az eredeti RNS-t és egy egyszálú DNS hurokkal hozzákapcsolódó komplementer DNS-láncot- A reverz transzkriptáz ugyancsak katalizálja azt a reakciót, amely templátként (mintaként) egyszálú DNS-t használ, és amikor olyan kétszálú, hajtó-szerű DNS molekula jön létre, amelynek a végeit egyszálú DNS hurok köti össze [Aviv és Decer, Proc. Natl. Acad, Sei., USA, 69, 1408, 1972, és Efstratiadis, Kafatos, Maxam és Maniatis, Cell, 7,279 1976]. A restrikciós endonukleázok olyan enzimek, amelyek' a kétszálú DNS molekula foszfodiészter-kötéseit bidrolizálják, ezzel a DNS-láncban töréseket hoznak létre. Ha a DNS molekula zárt körként létezik, úgy az az enzimek hatására lineáris szerkezetűvé alakul át. Alapvető tulajdonsága ezen enzimeknek, hogy a hidrolitikus hatás csak különleges nukleotid-sorrenddel rendelkező molekula részeken következik be. Ezeket a bázis-sorrendeket a restrikciós endonukleázok felismerik. Különböző forrásokból izoláltak restrikciós endonukleázokat, és oly módon jellemezték őket, hogy meghatározták azokat anukleotid-sorrendeket, amelyeket felismernek. Egyes restrikciós endonukleázok mindkét szálon hasonló ponton hídrolizálják a foszfodiészter-kötéseket, amikor sérült végű molekulák jönnek létre. Más enzimek néhány nukleotiddal egymástól elválasztott kötéseket hidrolizálnak, amikor a megtámadott molekula mindkét végén szabad egyszálas szakaszok jönnek létre. Ezek az egyszálas végek önmaguk komplementetjei, kohézív erőkkel újra összekapcsolhatják a hidrolizált DNS-t. Mivel bármely, ezen enzimekre érzékeny DNS-molekula azonos, a felismerést elősegítő bázis-sorrendet kell hogy tartalmazzon, azonos kohézív végek jönnek létre, így a restrikciós endonukleázokkal kezelt különböző szekvenciájú DNS-molekulák összekapcsolódhatnak (Roberts, Crit. Rév. Biochem., 4., 123, 1976). A restrikcióshelyek általában ritkán fordulnak elő, azonban a restrikciós endonukleázok felhasználhatóságát nagymértékben erősíthetjük a restrikciós helyekre jellemző bázis-szekvenciákat tartalmazó kétszálú oligo-nukleotidok kémiai szintézisével. Ily módon gyakorlatilag bármely DNS szegmenst hozzákapcsolhatunk bármely más szegmenshez oly módon, hogy a megfelelő restrikciós oligo nukleotidot hozzákapcsoljuk a molekula végéhez, majd az így előállított vegyületet a megfelelő restrikciós endonukleázzal hidrolizáljuk, és így előállítjuk a kohézív végű molekulákat (Heynekker, Shine, Goodman, Boyer, Rosenberg, Dickerson, Narang, Itakura, Lin és Riggs, Nature, 264, 748, 1976, és Scheller, Dickerson, Boyer, Riggs és Itakura, Science, 196,177,1977). Az Si jelű endonuÚeáz olyan enzim, amely hidrolj-191 803 5 1C 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
