191749. lajstromszámú szabadalom • Eljárás haploid magok előállítására zárvatermő növényeknél haploidok előidézésével apomixis kiváltása útján
1 191.749 2 2. táblázat Magok átlagos súlya Dózis Kezelés ideje Apomixikus szer • 0,6 kg/ha 4,4 kg/ha 3 nappal az anthesis előtt 11,3 mg/mag 2,5 mg/mag 2 nappal az anthesis előtt 28,7 2,5 1 nappal az anthesis előtt 28,3 3,9 anthesis 1 1 nappal az anthesis után 21,7 4,4 35,1 2,6 2 nappal az anthesis után 36,1 25,3 3 nappal az anthesis után 42,7 38,7 4 nappal az anthesis után 47,0 Kontroll magok Kezelés nélkül: 45,1 mg/mag Csak Triton AG-98 adjuvánssal kezelve: 43,4 mg/mag. Kézzel emaszkulált, 3 nappal az anthesis előtt kezelt növény hímporával beporzott növény: 44,1 mg/mag. Az alacsonyabb súlyértékek a haploiditásra utalnak. 3. példa Különböző, kemény, vörös téli búzafajta magát (saját keresztezés harmadik generációja) 2 C-on előcsíráztattuk, majd 16,5 cm-es cserepekbe ültettük és melegházi körülmények között neveltük, amíg növekedésük a 9-fokozattól kb. a 10. növekedési fokozatukat („late boot”) elérték. (A fokozatok értelmezése megfelel a gyakorlatban alkalmazott Feeks-féle osztályozásnak, lásd Feeks W.: „De tarwe en haar milieu” Versi. tech. Tarwe Comm. 12, (1941), 523 -888.) Ekkor a növényeket 1,1, 2,2 és 4,4 kg|hektár meny nyiségben kálium-1- (4-klór-fenil)- 1,4- dihidro- 4- -oxo-6-metil- piridazin-3- karboxiláttal kezeltük, majd minden egyes növény minden egyes hajtását megjelöltük, így jelezve a növekedési fokozatot és a kezelés időpontját. Két héttel a kezelés után bekövetkezett az anthesis a magokon. Kb. 21 nappal az anthesis után, az apomixis jellegű éretlen magokat — például azokat, amelyeknek scutellái szabálytalanok és endospermájuk tiszta és folyékony - eltávolítottuk, csíráikat kipreparáltuk és indol-ecetsav tápanyagot is tartalmazó Miller-féle agar-szójabab-callus táptalajra helyeztük és szobahőmérsékleten hagytuk növekedni. ______ . A megnövekedett és gyökereket és hajtásokat Hozott csírákat ezután friss Miller-féle táptalajt tartalmazó vizsgálócsőbe tettük át, majd a csöveket 21°C környezeti hőmérsékletű térben 14 órás világos és 10 órás sötét ciklusban növesztettük. Miután a palánták gyökereket^* kb. 7,6 cm hosszú hajtásokat hoztak, 50 napra 2°C hőmérsékletű előcsíráztató kamrába helyeztük, majd talajba ültettük át, és melcgházi körülmények között 5 napig növesztettük. Ekkor a gyökércsúcsból mintát vettünk a kromoszómaszám meghatározására. A gyökérmintákról a talajmaradékot lekeféltük, vízzel lemostuk és mindegyiket egy-egy, 1/3 részéig, telített vizes 1-bróm-naftaíin oldattal megtöltött fiolába helyeztük és ott tartottuk 3-4 órán át. A mintákat ezután egy másik, 1 ml 3 rész abszolút etanolt és 1 rész jégecetet tartalmazó fiolába tettük át és valamivel több mint 1 órán át bennehagytuk. Ezután ismét másik fiolába tettük őket 5,5-7 percre, amelyek 5 n sósavat tartalmaztak. Ezután a gyökérmintákat desztillált vízzel leöblítettük és feulgen színezőoldatba helyeztük őket. A színezőoldatot a következőképpen készítettük: 100 ml fövő vízben rázogatással feloldunk 0,5 g bázikus fuxint, az oldatot lehűtjük 50°C-ra, sötét színű üvegbe szüljük, hozzáadunk 15 ml 1 n sósavat, majd tovább hűtjük 28°C-ra és kb. 1,5 g kálium-metabiszulfitot adagolunk hozzá, és rázás közben feloldjuk. Az oldatot egy éjszakán át hűtőszekrényben tartjuk, hozzáadunk 1—2 kanál aktív szenet, ismét sötét üvegbe szűrjük, a fiolákat bedugaszoljuk és hűtőszekrényben tároljuk a felhasználásig. A színezőanyagot tartalmazó fiolákból a gyökérmintákat eltávolítjuk, üveglemezkékre helyezzük és a megfestett terület kb. felét levágjuk. A maradék részre egy csepp acetokarmint cseppentünk, és fedőlemezzel lefedjük és enyhe nyomással a mintákat összepréseljük. A lemezeket ezután mikroszkóp alatt vizsgáljuk és meghatározzuk a kromoszóma számot. A kromoszóma számot a kezeletlen növényeken is meghatározzuk. Ezek magját petricsészébe, nedvesített szűrőpapírra helyezzük, csírás felületükkel felfelé, Szobahőmérsékleten csíráztatjuk 48 órán át, amíg a primer gyökér kb 2,3 cm-re növekszik és a kromoszóma számot ezekből a fentiekhez hasonlóan határozzuk meg. A kapott eredményeket a 3. táblázat ban foglaltuk össze. (Az 5. sorozat sejtjei nem tartalmaztak megszámlálható kromoszómákat.) Mivel a kemény, vörös búzafajta sejtjeinek normál kromoszóma száma 42, a 21-es kromoszóma szám a haploid növényeket jelzi, míg a 21 és 42 közötti kromoszóma számok arra utalnak, hogy a kromoszómák egy endoreprodukciós folyamaton mennek keresztül, amelyek befejeződve, például a növény utolsó fejlődési szakaszában, kettős haploidokat eredményeznek. Meg*orozet Apornlxikus szer kg/hektér Kezelés (fejlődési fokozat) Kromoszóma szá m/sej t/n övén y 1 0 42,42,42,42. 1 0,9 korai „boot” 28. 35, 28 1 . 0,45 koréi „boot" 21,25, 21,28 2 0 — 42.42 2 0,90 korai „boot" 21,28, 21,42,42.28 2 0,90 korai „boot" 21,21.28 2 0,90 korai „boot" 21,21 2 0,90 korai „boot" 21,21.21,28 4 0 — 42.42.42 4 0,90 késői „boot" 21,42,42,37.28,28 28,21,25,20,21 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 9
