191737. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új immunmodulátor hatású hisztidin-peptidek előállítására
1 191.737 2 telített bórsav-oldattal nyolcszor, 5%-os nátriumhidrogén karbonát oldattal hatszor extraháljuk végül a szerves fázist vízmentes magnézium-szulfáttal szárítjuk és vákuumban bepároljuk. 0,44 g (66%) vékony rétegkromatográfiai lag egységes terméket kapunk. Op 149 152 °C RfA 0,71 Analitikai vizsgálathoz az anyagot 4 órán át szárítottuk vákuum-pisztolyban 80 °C-on P204 felett. Elemanalízis a C36H4,NS06 összegképlet alapján <M = 639 764) számított, % C 67,59 H 6,46 N 10,95 talált, % C 68.09 H 7,60 ISI 9 13. IR 3300 (NH-, amid), 1740 (OO, észter), 1680 (C=0 Z ), 1640 (C=0, amid), 690 és 750 (aromás monoszubszt.) cm"1 3. lépés H-Nle-His-Phe OH. CH3 COOH 0 46 g (072 mmól) Z Nle-His Phe OBzI t jégecetben feloldunk és 0 1 g 10%-os paliádium-csontszén katalizátor jelenlétében hidrogéngázt buborékoltatunk át az oldaton a C02-Iehasadás megszűnéséig (mintegy 4 óra) A katalizátort kiszűrjük, a szürletet vákuumban bepároljuk és az olajos maradékot acetonnal eldörzsöljük A terméket metanol és éter elegyéből átkristályosítjuk. Hozam 0,20 g (55%) vékonyrétegkromatográfiailag egységes. Op 233 235 °C RdA 0,50 Rfc 0 47 [a] + 7,0° (c 0,5, metanolban) Analitikai vizsgálathoz az anyagot 3 órán át szárítjuk vákuumpisztolyban 80 °C-on P2Os felett. Elemanalízis a C21Hí9N504.1,5 CH3COOH összegképlet alapján (M = 505 582) számított, % C 57 42 H 6,98 N 13,85 talált, » C 56 94, H 7,14 N 14,28. IR 3500 -2500 (OH , karbonsav), 3300 (NH-, amid), 3300 és 3350 (NH-, amin, összeolvadt az előbbiekkel), észter, Z- (C=0) hiányzik 1640 (C=0 amid és amin NH- összeolvadt) cm“1 5. példa 1. lépés Boc Met-Gly-His(Z)-Phe OMe 0,75 g (1 75 mmól) Boc Met-OH.DCHA 7,5 cm3 éterrel készített szuszpenzióját 4,8 cm3 5% os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal kétszer extraháljuk utána a vizes fázist kétszer éterrel. Az egyesített éteres fázisokat vízzel kétszer mossuk vízmentes magnézium-szulfáttal szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot 10 cm3 dimetil-formamidban oldjuk és az oldathoz keverés közben 1,17 g (1,75 mmól) H-Gly-His(Z) Phe-OMe 2HBr 20 cm3 dimetil-formamiddal készített oldatát adjuk. A reackióelegyhez 0,36 g (1 75 mmól) diciklohexil-karbodiimidet, 0,49 cm3 (3,50 mmól) trietil-amint és 0,24 g (1,75 mmól) hidroxi-benztriazolt adunk. A reakcióelegyet 3 napon keresztül szobahőmérsékleten keverjük. A kivált diciklohexil karbamidot kiszűrjük, a szűrlétét vákuumban bepároljuk és az olajos maradékot kloroformban feloldjuk. Az oldatot háromszor 5%-os nátrium-hidrogén karbonát-oldattal majd háromszor 0,1 n sósav-oldattal extraháljuk utána vízmentes magnézium-szulfáttal szárítjuk és vákuumban bepároljuk A maradékot kloroform és éter elegyéből kristályosítjuk. Termelés 0 22 g (17%) A terméket további tisztítás nélkül vetjük alá lúgos hidrolízisnek 2 lépés Boc-MetGly-His-Phe OH 0. 0792.g (0,107 mmól) Boc-Met Gly His(Z)-Phe- OMe 1,61 cm3 metanolban oldunk, és az oldathoz 0,24 cm3 1 n nátrium-hidroxid oldatot adunk. Az oldatot szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük, majd jeges hűtés közben 0,24 cm3 1 n sósav oldattal semlegesítjük, Termelés 0,0325 g (51%), vékonyrétegkromatográfiailag egységes Op. 146 148 °C RfA 0,54 Rfc 0,59 [a]2(3 , —7,8° (c 0 5 metanolban) C2;H38N607S Ms 590,71 Aminosav analízis Met Gly Phe His 1,00 0,97 1 00 0 96 UV színkép szerint az imidazol gyűrű nincs szubsz - tituálva. Az új immunmodulátor peptidek biológiai hatását in vitro vizsgáltuk a monocita és polimorfonukleáris (MN PMN) sejtek mozgására a közvetlen kemotaktikus hatás, illetve az inkubálás után más kemotaktikus hívójelre adott kemotaktikus válaszkészséget növelő képesség tesztelésével. Összehasonlító klsérle teket végeztünk egészséges egyének. Hodgkin kóros és systemas lupus erythematosusban szenvedő betegek esetén. A levamisol azonos körülmények között mért hatása szolgált összehasonlítási alapul. A vizsgálatokat módosított Boyden-eljárással végeztük a korábban publikált kísérleti körülményekkel azonos módon (K. Lukács és társai Acta Med. Acad. Sei. Hung. 37 145, 1980, K. Lukács és társai, Immunopharmacology 7, 171, 1984). Eredményeink azt bizonyítják, hogy az általunk vizsgált peptideknek kétféle tehetséges hatása van. 1. levamisol-szerű immunstimuláns 2. kemotaktikus A kettős hatás szoros összefüggést mutat a peptidek szerkezetével. Rendszerünkben (kemotaxis kamra) azonban ezen két hatás végeredménye mérhető. A mérések szempontjából előnyös volt, hogy éppen a Boc Met-His-Phe-OMe nek nincs erős kemotaktikus aktivitása, így levamisol-szerű hatása jól értékelhető volt. Eredményeinket elemezve megállapíthatjuk hogy a For-Met-His-Phe-OMe nek mindkét (MN, PMN) sejttípusra erősen szignifikáns kemotaktikus hatása volt, míg a Nie His-Phe gyengébben de mindkét sejttípusra hatott, a For-Nle-His-Phe OMe csak monocitákon volt hatásos. A For-Met-His-PheT)Me, amely az általunk vizsgált mindkét sejttípuson egészségesek és betegek esetében egyaránt erősen szignifikáns kemotaktikus hatást mutatott a random migrációhoz képest, hatásában esetenként megközelítette a komplement eredetű kemotaktikus faktorral kiváltott aktív mozgás mértékét. Adataink alapján látható, hogy a Boc Met-His-Phe-OMe-nek nincs kemotaktikus hatása, de a levamisol-szerű immunstimuláns4hatása MN és PMN sejte-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
