191713. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított detoxikált endotoxint tartalmazó kompozíció előállítására
1 191.713 2 /ul vizsgálati anyagot tartalmazó oldattal, amely standard endotoxint, illetve jelen találmány szerinti TDE-t, illetve kontrollként fiziológiás sóoldatot tartalmazott, ilyen módon képeztünk három különböző vizsgálati oldatot. Minden oldat 1 pg vizsgálati anyagot és 20 /ul fluoreszcens gyöngy szuszpenziót tartalmazott. A vizsgálati oldatokat egyenként mikroszkóp lemezre helyeztük és 90 percen át inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten, Az inkubálás után a lemezeket fluoreszcens mikroszkóp alatt megvizsgáltuk. Vizuális megfigyeléssel meghatároztuk azoknak a sejteknek a számát, amelyek fluoreszcens gyöngyöt nyeltek fagodtózissal, valamint a sejtenként elnyelt gyöngyök számát. A fagocitózis indexet a következő képlettel összhangban számítottuk ki: FAGOCITÖZIS INDEX* % fagodtáló sejt «gyöngyök száma 100 sejtenként és két kísérlet eredményeit a IV. táblázat mutatja be. IV. táblázat Fagocitózis index 1 kísérlet 2 kísérlet Endotoxin standard 5,0 3,6 TDE 5,4 4,1 Kontroll 1,0 0,5 Amint a IV. táblázatból látható, a jelen találmány szerinti TDE-nél a fagocitózis-index szignifikánsan nagyobb, mint a standard endotoxinnál, ezáltal megállapítható, hogy a TDE a makrofágok jelentősen hatásosabb stimulátora. (4) Adjuváns aktivitás Hogy a TDE alkalmazását a melegvérű állatok immunrendszerének stimulátoraként tovább bizonyítsuk, a TDE-t adjuvánsképességre is megvizsgáltuk olyan módon, hogy meghatároztuk immunválasz - -fokozó képességüket birka vörösvérsejtekre (SRBC). Ezt olyan módon hajtottuk végre, hogy az antitestek birka vörös vérsejt lizáló képességét mértük. Három vizsgálati anyagot készítettünk. Mindegyik 1- 107 SRBC-t tartalmazott. A 2. sz. vizsgálati anyag ezen kívül 20 mcgs. standard endotoxint, míg a 3. sz. vizsgálati anyag 20 mcgs jelen találmány szerinti TDE-t tartalmazott. A vizsgálati anyagot interperitoneálisan adtuk be BALB/C egereknek. 4-5 nap után a vizsgálati állatokat leöltük és lépüket eltávolítottuk, a lépeket szövet-őrlőben megőröltük. Minden lépből standard sejt-szuszpenziót készítettünk hemodtométert alkalmazva, és a fenti szuszpenziók mindegyikét lemezekre helyeztük a cél SRBC-vel, tápközeggel és agarral együtt. A lemezeket 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk és tengerimalac szérumot adtunk komplement-forrásként minden egyes lemezhez, ezt további 30 perces inkubálás követte 37 °C hőmérsékleten . Ezek után a lemezeket megvizsgáltuk, hogy meghatározzuk a tarfolt-képző sejtek mennyiségét, amelyek azok a területek, amelyekben az antitestek öszszer on csőit ák az SRBC sejteket a tengerimalac-szérumban található komplement segítségével. Az eredményeket az V. táblázat mutatja be. V. táblázat Vizsgálati anyag PFC/2-10* lépsejtek SRBC 88 SRBC + Endotoxin standard 165 SRBC + TDE 219 1 -----------—— ■ ■ ■ —------- ■'1 ———— ..... — Amint a III. táblázatból látható, a tarfoltot képező sejtek száma, amely a TDE alkalmazásának eredményeként jött létre, a standard endotoxinnál elért eredményhez képest jelentősen nagyobb, amely megalapozza azt a megállapítást, hogy a TTE hatásos adjuváns . A TDE-t, amikor a jelen találmány szerint alkalmazzuk, gyógyászatilag elfogadható közeggel kombinálva lehet beadni, pl. fiziológiás sóoldattal vagy olaj-cseppes emulzióban. Az említett kompozídót lehet stabilizálni pl. liofilezéses módszerrel, majd visszaállítani a hatás bármiféle elvesztése nélkül. Amint fentebb leírtuk, a melegvérű állatok és az emberek kezeléséhez használható kompozíciót lehet olajos cseppemulzió formájában alkalmazni. Az alkalmazott olaj mennyisége 0,5—3 térfogat% között lehet a kompozíció teljes térfogatára vonatkoztatva. Előnyösen 0,75—1,5 térfogat% olajat célszerű alkalmazni. A megfelelő olajokra példák könnyű ásványolaj, szkvalén, 7-n4iexil-oktadekán, Conoco szuperolaj és Drakeol GVR ásványolaj (a Pennreco Company , Bulter, Pennsylvania cég termékei). A homogenizált olaj-tartalmú keveréket azután egyesítjük valamely detergenssel, amelyet kívánt esetben fel lehet oldani fiziológiás sóoldatban az összekeverés előtt. A detergens mennyisége tipikus esetben 0,02 és 0,2 térfogat% között van, előnyösen 0,1 és 0,2 térfogat% között a kompozídó teljes térfogatára vonatkoztatva. Bármilyen közönséges detergens-anyagot lehet használni, beleértve a Tween 80-at, és az Arlacelt (az Atlas Chemical Company gyártmánya). A detergens hozzáadásával keletkezett keveréket ezután homogenizáljuk, szuszpenziót képezve, amely nagy százalékban olyan olajcseppeket tartalmaz, amelyek TDE-vel vannak beburkolva, amint ezt mikroszkóp alatti megfigyeléssel meg lehet határozni . A TDE mennyisége egy injekcióban 5 és 500 pg, előnyösen 10 és 100 jug között van (70 kg-os felnőtt teljes testsúlyára vonatkoztatva). 1—3 injekciót adunk be kb. 2 hónapos periódus alatt. A jelen találmányban alkalmazott TDE kompozíció szignifikánsan kisebb pirogén aktivitást mutat, mint az a kompozídó, amely standard endotoxint tartalmaz, amely tényt a következő példa bizonyítja-Három Uj-Zéland törzsből származó patkányt injekdóztunk be (füli vénába) standard endotoxint tartalmazó kompozídóval. A standard endotoxinnak azt a mennyiségét, amely ahhoz szükséges, hogy a testhőmérsékletben legalább 0,46 °C hőmérséklet-növekedést okozzon a vizsgálati populádó 50%-ában, 3 órán periódusban határoztuk meg, végbél-hőmérőt alkalmazva. Három másik vizsgálati patkányt szintén injekd& 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
