191609. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás glükóz tartalmú cukorlé izomerizálására
5 191 609 6 Tekintve, hogy a glükóz-izomeráz az említett és egyéb más mikroorganizmusok tipikusan sejtközi terméke, glükóz-izomeráz forráshoz egyszerűen a sejtek kinyerésével juthatunk. A sejtekből a glükóz-izoinerázt a szakmában ismeretes technikákkal, például hanghullámokkal történő roncsolással választhatjuk el, és ismert, hagyományos tervezésű enzim-reaktorban hasznosíthatjuk. A jelen találmányban hasznosított glükóz-izomcrázt — tekintet nélkül származási módjára - előnyösen egy inert szubsztrátumon rögzítjük szokványos módszerekkel. Az enzimek rögzítésére használt anyagok és eljárások jól ismertek, és számos közleményben ismertetésre kerültek, köztük Wang és munkatársaiéban (Fermentation et Enzyme Technology, John Wiley et Sons Inc., New York, ,1979, pp. 318—338), valamint Kirk-Othmerében (Encyclopedia of Chemical Technology, 3. kiadás, John Wiley et Sons Inc., New York, 1980, 9. kötet, pp. 148-172). A glükóz-izomeráznak az eljárás megvalósítása során bekövetkező denaturálódását csökkentendő, illetve inhibitálandó, kísmennyiségű kobalt kation és/vagy a kénessav valamely vízoldható sójának, mint nátrium-szulfit, nátrium-biszulfit, magnézium-szulfit és/vagy magnézium-biszulfit jelenlétével is számoltunk — a 28,885 számú újkiadásű USA-szabadalomban leírtak nyomán. Célszerű, hogy a glükóztartalmú kiindulási lé szénhidrát koncentrációja 20 és 85, előnyösen 40 és 65 tömeg% közé essék, ha a kívánt eredményt akarjuk elérni. Az is szükséges, hogy az izomerizációs reakció 3-tól 8-ig, előnyösen 4-től 7-ig terjedő pH-értékű közegben játszódjék le. Az eredmény akkor a legjobb, ha a pH 5 és 6,5 között van. Amennyiben az izomerizációs reakció során a pH értéke az előbb említett határok alá, vagy fölé kerül, nemkívánatos melléktermékek keletkezése kerül előtérbe, mint például a pszikóz, szerves savak, színes termékekés elővegyületek, fruktóz-dianhidridek és hasonlók. Úgy találtuk, hogy a glükóz-izomeráz optimális aktivitásához tartozó pH-érték a hőmérséklet emelkedésével jelentősen lefelé tolódik. így a Streptomyces rtibingenosusból termelt glükóz-izomerázra nézve az aktivitás-optimum 25 °C-on 8.6—9.2 pH-értéknél, 75 °C-on 6.9—7.5 pH-értéknél, 125 °C-on pedig 5.6— 6.2 pH-értéknél van. Ezért ha a hőmérséklet az izomerizáció közben emelkedik, a pH-t csökkenteni kell, hogy fenntartsuk a maximális enzim-aktivitást és azonkívül elkerüljük melléktermékek jelentkezését. A jelen eljárást illetően a kontaktidő arra az időtartamra korlátozódik, amely ahhoz szükséges, hogy a reakciókeverékben jelenlévő összes szénhidrátra számítva legalább 53-60 tömeg%-os fruktóz-koncentrációt érjünk el. Miután a glükóz-tartalmú kiindulási lé összetétele a majdnem fruktóz nélküli, vagy fruktózt egyáltalán nem tartalmazó tiszta glükóz oldattól akár 52 % fruktózt tartalmazó glükóz oldatig mehet, a reakcióidő a kiindulási lé természetétől függően változhat. Ennek következtében 1 másodperctől több óráig terjedő kontaktidő is előfordulhat, noha a rendszerint előnyösnek bizonyult érintkezési Időtartam 2 és 30 perc közé esik. A glükóz-izomeráz és a glükózt tartalmazó lé közötti előnyös kontaktidő nagymértékben függ attól a pH-értéktől, amelyen az izomerizációs reakciót vezetjük. Alacsonyabb pH-nál hosszabb kontaktidő engedhető meg anélkül, hogy a glükóz és fruktóz pszikózzá, illetőleg egyéb nemkívánatos bomlástermékekké degradálódását okoznánk. Az ajánlott pH-tartomány felső értékeinél rövidebb kontaktidő szükséges a pszikóz és színanyagok képződésének elkerüléséhez. A gyakorlatban azt az időt vesszük effektiv kontaktidőnek, amelyet a glükóz-tartalmú szörp a reakció véghőmérsékletén, vagy ahhoz közelálló értéken tölt, mivel a cukorbomíási reakciók, melyek itt előfordulnak, nem enzirnatikus jellegűek, és lejátszódnak, akár érintkezik a lé a glükóz-izomerázzal, akár nem. Emiatt, 90 °C hőmérséklet felett vezetett izomerizációs reakciók esetén fontos minimalizálni a glükóz lé kívánt izomerizációs hőmérsékletre melegítésének időtartamát (például a lének gőzzel való keverése útján az izomerázzal történt érintkeztetés alatt vagy azt közvetlenül megelőzően), és amint elértük a kitűzött fruktóz szintet, azonnal el kell választani a reakciöclcgyet az aktív i/omeráztól, és amilyen gyorsan csak lehet, le kell hűteni legalább 90 °C, de inkább 70 °C alá. Ha glükóz-izomerázt oldható formában alkalmazunk, inaktiválni kell (például a pH olyan mértékű csökkentésével, mely inaktiválja az izomerázt) még a lehűtés előtt, hogy elkerüljük a magas hőfokú izomerizáció folyamán keletkezett fruktóz glükózzá történő visszaalakulását, lévén az izomerizációs reakció természetesen reverzibilis. A glükóz fruktózzá alakulásának elérhető legnagyobb mértékét a glükóz és fruktóz közötti termodinamikai egyensúly határozza meg, amely viszont a reakció hőmérsékletének függvénye. Glükóz és fruktóz egyensúlyi clegycinck igen gondos elemzéséből az alábbi összefüggést állítottuk fel; F = 100/(K + 1) (D >"K “-T+ 273 +U005 (2) ahol F a glükóz és fruktóz összsúlyára vetített egyensúlyi fruktóz-koncentráció tömeg%-ban, T az a °C- ban kifejezett hőmérséklet, amelyen a reakciót lejátszatjuk, K pedig a glükóz/fruktóz egyensúlyi állandó. A glükóz-tartalmú szörp és az izomeráz közötti aktuális kontaktidőt az esetben, ha a reaktorban az izomeráz rögzített formában van jelen, a következő képlettel számíthatjuk ki: ahol í = az aktuális konlaktidő, C = a glükóz és fruktóz. együttes koncentrációja, V = a töltet szabad folyadéktérfogata (töltet-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
