191603. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai reagens és eljárás hidrofil latexrészecskéket tartalmazó szuszpenziók előállítására
9 191 603 10 11. példa (lalex)-OCHj-CH-CHj +Na,S(lalex)-OCHj \/ -------O-CH-SH I CHjOH + CH-CO\ >CO-CH, I N-(CH215-COO-NÎ CH-CCT CO-CIfi (lalexj—OCHj -CH-S-CH-CCK I I N-(CH2)5-COO-N CH2OH CH,--CO CO-CHj CO-CHj 5 10 15 Az 1. példa szerint készített latex-szuszpenzióból 20 mi hez 0,5 g Na3S'9H202-t adunk, és az elegyet 2 napon keresztül szobahőmérsékleten keverjük. Utána a szuszpenziót addig dializáljuk folyó desztil- 20 Iáit vízzel szemben, míg szag már nem észlelhető. A szuszpenziót centrifugáljuk. A száraz anyag mintegy 2 t% kent tartalmaz, ami körülbelül minden 10. epoxiegység átalakulásának felel meg. Mert a reakció a részecske felületén inkább valószínű, a felületen 25 több átalakult epoxiegység is lehet. A kiccntrifugált termékhez 1 g 6-maleinimídohexánsav-hídroxi-szukcinimíno-észter 6 ml dimetilformamiddal készített oldatát adjuk, az elegyet szobahőmérsékleten 3 órán át. keverjük, majd folyó desztil- ^0 Iáit vízzel szemben 12 órán át dializáljuk. 12. példa J > Latex-gamma-globulin-konjugátum előállítása 1 ml gamma-globulin-oldathoz (protein-tartalma / -, 56,6 mg) a) az 1. példa szerint előállított, b) a 9. példa szerint, c) a 10. példa szerint és d) a 11. példa szerint módosított HO latexszuszpenziót adjuk 20-20 ml mennyiségben. A kapott elegyeket szobahőmérsékleten 12 órán át dializáljuk, majd centrifugáljuk. A felülúszó részben levő szabad protein mennyiségét meghatározzuk, és ebből kiszámítjuk a latexrészecskéken kötött protein- B0 mennyiséget. A számítások szerint a protein az alábbi mennyiségekben kötődött: a) 8 mg gamma-globulin b) 43 mg gamma globulin c) 15 mg gamma-globulin 3 d) 19 mg gamma-globulin 13. példa 60 Latex-IgG-konjugátum előállítása állítunk elő. A latcxrcszecskckhez kötődött igG-molekulákat nntUcst-kompIcxkcpzéssct mulatjuk be. (A 14. és a 15. példában egy-egy diagnosztikai eszközt szemléltetünk a találmány szerint előállított hidrofil latexrészecskék alaklmazásának példáiként. A 14. példában a tiroxinnek (T4-nek)ajuh aníi- T4-szérumából nyer T4-antitestek segítségével végzett immunológiai meghatározását írjuk le, mig a 15. példa az emberi szérumban levő tireotropin (TSH) meghatározására vonatkozik, amely a kettős antitest elválasztásának technikájával történik. 14. példa A homopoliglicidíl-metakrilát-Iatexrészecskék alkalmazása a juh anti-T4-szérumának hordozójaként; diagnosztikai eszköz a T4-ELISA- teszt végrehajtásához. A tiroxinnak (T4-nek) ELlSA-teszttel történő meghatározása céljából először a juh anti-T4-szérumáböl származó T4-antitesteket kovalens kötéssel a hidrofil homopoliglicidil-mctakrilát latex részecskékhez kötjük oly módon, hogy a latexet a 7-9. példák valamelyike szerint módosítjuk, majd a 12. példa szerint a T4-antitestekkei érintkeztetjük. Az így kapott solid-face-antitestek a teszt első reagensét képezik. Második reagensként tiroxint önmagában ismert módon alkalmas enzimmel, például peroxidázzal (POD) vagy fl-galaktozidázzal (j3-Gal) jelölünk, azaz enzim-konjugátummá „kapcsoljuk”. Enzimként jelen példában jß-galaktozidazt alkalmazunk. A harmadik reagenst az ismeretlen T4-tartalmú minta képezi, míg negyedik reagensként az enzim-konjugdtum ß- Gal-tartalmának szubsztrátumaként alkalmas anyagot, jelen esetben nitro-fenil-/3-galaktozid 7,3 pFI-jú trisz- HCl-pufferrel készített oldatát használjuk. A teszt eleve az alábbi három lépésen alapul: 1. A hidrofil latexrészecskékhez kovalensen kötött T4-antitestek reakcióba lépnek mind az enzimmel jelölt tiroxinna! (az enzim-konjugátummal), mind a mintában levő szabad tiroxinnal. A reakció során a solid-face-antitestek és az enzim-konjugátum, valamint a minta tiroxintartalma között kompetitiv kötés alakul ki. 2. A B/F-elválasztás (B 7 b und, F = free) során az enzim-konjugátum kötött (bound) és nem kötött (free) részét elválasztjuk. Az elválasztást célszerűen centrifugálással vagy például vízzel vagy alkalmas pufferoldattal szembeni dialízissel végezhetjük. 3. Az enzim kimutatását szolgáló reakció, amely az enzim-konjugátum és az alkalmazott enzimre fajlagos szubsztrátum között zajlik le. A reakciót vagy kolorimetrikusan vagy más ismert módon követhetjük. Az enzim-aktivitást vagy a lecentrifugált folyadékban (free-rész) vagy az újból felszuszpendált csapadékban (bound-rész) mérjük. A kísérlet végrehajtása A 12. példában leírt módon IgG-oldatból és különböző latexszuszpenziókból latex-IgG-konjugátumokat A fenti leírt módon készített latex-anti-T4-szusz- 65 penziót vízzel vagy pufferoldattal 1:1000 térfogat-6
