191501. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izoelektromos fókuszálásnál alkalmazható amfolitok előállítására és az eljárás során alkalmazható berendezés
1 191 501 2 való hígítással állítják be. A három komponens (I, II és III) elegyítési aránya : I : II : III = 1 : (2-4) : (2—4). A berendezés tartalmaz sorbakapcsolt négy oszlopot (B, C, D, E) és argongáz előkezelésére, a negyedik oszlop (E) nyomásszabályozott elosztó tartályon (F) át kapcsolódik a nyers kiindulási anyagot befogadó reakciós edényhez (H), amely utóbbi hűtőn (K) át kapcsolódik a szedőhöz (SZ), amelynek fő áramlási útját egy-egy szelepen (Lt, L2) át sorbakapcsolt első tartály (M,), második tartály (M2) és - vákuum-megbontás nélkül cserélhetően kialakított és elrendezettszedőlombik (M3) alkotja, míg az első tartályba (M,) kapilláris végződéssel benyúló csővel - harmadik szelepen (Lj) át - higanydiffúziós pumpa és - negyedik szelepen (L4) át - a második tartály (M2) kapcsolódik. A találmány szerinti új eljárással a technika állásához képest kedvezőbb feltételekkel végezhető az izoelektromos fokuszálásnál alkalmazható amfolitok előállítása; a találmány szerinti új berendezés alkalmazása az eljárás egyes lépéseiben javítja az üzemi körülményeket. Az izoelektromos fokuszálás egy mindjobban elterjedő módszer pl. fehérjék és más polielektrolitok szétválasztására. A módszer nyilvános ismertetése után (Svensson, 1961) kiterjedt kutatás kezdődött megfelelő hordozó amfolitok kifejlesztésére. A hordozó amfolittal szemben támasztott - részben ellentétes tendenciájú - követelmények egyidejű maradéktalan kielégítése igen problematikus. Biztosítani kell, hogy a kívánt (továbbiakban: üzemi) pH-tartományban lineáris (közel-lineáris) legyen a pH-gradiens és az amfolitnak a pH-gradiens bármely pontjában jó legyen a vezetőképessége, megfelelő legyen a pufferkapacitása, ne lépjen kölcsönhatásba a pH-gradiensbe bejutott fehérjékkel és ne változtassa meg azok tulajdonságait, továbbá legyen csekély a fényelnyelése. A linearitás biztosítása mellett kívánatos, hogy a vezetőképesség az üzemi tartomány egyetlen pontjában sem csökkenjen 100 pS alá, sőt lehetőleg legyen ennél az értéknél nagyobb, az amfolit pufferkapacitása pedig legyen az üzemi tartomány bármely pontjában viszonylag nagy és egyetlen pontban sem csökkenjen a 0,50 ekv/L érték alá. Ismeretes, hogy ilyen tulajdonságok elérhetők a poliamino-polikarbonsav elegy alkotta amfolitokkal. [lásd pl. Vestenberg, Acta Chem. Scand., 23, (1969)] A felsorolt követelmények közötti kompromisszum azonban a technika állása szerinti amfolitoknál nem optimális és előállításuk nagyon költséges. A kereskedelmi forgalomban kapható készítmények közül pl. a viszonylag jó mutatókkal rendelkező Pharmalyte (gyártó : Pharmacia, Uppsala) és Servalyt (gyártó: Serva, Heidelberg) világpiaci ára (1982) DEM 200-210 körüli 25 cm3 kiszerelésre vonatkoztatva és bár a fent megadott határértékeknél a mutatók valamivel kedvezőbbek, a vezetőképességük a kritikus pH = 5-7 tartományban nem éri el a 200 pS értéket és a - különösen sótartalmú minták esetében kritikus - pufferkapacitás a pH = 4-9 tartományban pl. 0,1 ekv/L értékű. A Pharmalyte nevű amfolitot epiklórhidrin, valamint alifás D- és L-aminosavak szintézisével állítják elő [Viliems K.P., International Laboratorium No. 1 (1979)]. A Servalytot poli(amino-szulfonsav) és szulfo-, foszforsav-, karboxil- és guanidinocsoportokat tartalmazó aminosavak reagáltatásával állítják elő. A találmány alapja az a felismerés, hogy egyszerű módon és gazdaságosan előállíthatók a technika állása szerintinél kedvezőbb tulajdonságú amfolitok, ha háromkomponensű amfolitot állítunk elő úgy, hogy kiindulási anyagokként a homológ sort alkotó NH2—(CH2—CH2—NH)n—ÇH2 CH2 —NH2 - n értéke a képletben 2, 3, illetve 4 - általános képletű polietilén-poliaminokat alkalmazva, a komponensenkénti szintézis kiindulási anyagait csökkentett nyomáson, oxigén teljes kizárásával kondenzáltatjuk akrilsawal és az eltérő polimerizációs fokú reakciótermékeket - szükség szerinti tisztítás után - 35-45, előnyösen 40 tömegszázalékos koncentrációra hígítjuk. A homológ sort alkotó egyes kiindulási anyagoknak akrilsawal való reakciója olyan polikondenzációs reakció, amelynek terméke nem valamely szerkezetileg egyértelműen meghatározható amfoter vegyület, hanem a reakciótermék amfoter vegyületek - pontosan meg nem határozható összetételű - elegye. Ezért a háromféle kiindulási anyaggal kapott háromféle reakcióterméket e leírásban a továbbiakban H2N—(CH2—CH2—NH)2— —CH2—CH2—NH2 alapú (továbbiakban: I), H2N—(CH2—CH2—NH)3—CH2—CH2—NH2 alapú (továbbiakban: II), illetve H2N—(CH2— —CH2—NH)4—CH,—CH,—NH2 alapú (továbbiakban: III) reakcióterméknek nevezzük. Az így előállított amfolit pH-gradiensének linearitása gyakorlatilag megegyezik a technika állása szerinti említett amfolitokéval, de a vezetőképessége azokénál a kritikus pH = 5-7 tartományban mintegy 80%-kal nagyobb és a pufferkapacitása a pH = 4-9 tartományban sem csökken a 0,2 ekv/L érték alá, a kiindulási anyagok pedig egyfelől a kereskedelmi forgalomban könnyen hozzáférhetők, másfelől olcsók (a főreakciónál megkívánt különös reakciókörülmények biztosítása mellett is a késztermék amfolit 25 cm3-nyi adagjának forgalmi ára - egyezően számított cserearányok mellett - nem haladja meg a DEM 150-160 értéket). Előnyösen a homológ sort alkotó komponenseket, vagyis a I, II, illetve III reakciótermékeket I : II : III = 1 : (2-4) : (2-4) tartományon belüli, célszerűen 1:3:3 arányra elegyítjük oly módon, hogy a komponensenkénti polikondenzációs reakció lezajlása után a komponenseket egyenként 35-45, előnyösen 40 tömegszázaléknyi koncentrációra hígítjuk (kétszeresen desztillált vízzel), majd a kívánt arányban elegyítjük az egyes komponenseket tartalmazó oldatokat és az elegyítés után a kapott oldat összmennyiségére vonatkoztatott 0,4-10 tömegszázalékban palládiumot tartalmazó - csontszenes katalizátor jelenlétében, hidrogéngáz elnyeletésével redukáljuk a fényelnyelő hatás csökkentése céljából. A találmány szerinti lényeges jellemző tehát az, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
