191487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hup gént tartalmazó baktériumtörzs előállítására és nitrogénkötés fokozására
15 191 487 16 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás hup gént tartalmazó baktérium törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy Rhizobium japonicum telepeket porózus, steril hordozóanyagra replikázzuk, a felületen levő sejteket a hidrogenázukat derepresszáló körülmények között inkubáljuk, a hordozóanyagot belső légzést gátló anyagokat tartalmazó metilénkék-oldattal kezeljük, a hup gént tartalmazó törzseket a hordozóanyagot a hozzá kötődő telepekkel hidrogén atmoszférában tartva azonosítjuk, amikoris a hidrogént felvevő aktivitással rendelkező telepek a metilénkéket leuko formára redukálják. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozóanyagként szűrőpapírt használunk, az inkubálás folyamán a szűrőpapírt teleppel felfelé szilárd Repaska táptalajra tesszük, az inkubálást zárt térben végezzük, ahol az atmoszféra kezdeti összetétele körülbelül 5 % hidrogén, 5 % szén-dioxid, 0,7 % oxigén, míg a maradék nitrogén és az oxigén szintjét az inkubálás folyamán hagyjuk 0,1 % alá esni; ezután az oxigén szintjét oxigén ad' golásával 0,2 % körül tartjuk; olyan metilén-kék indikátor oldatot alkalmazunk, amely 200 mmól jód-ecetsavat, 20ö mmól malonsavat, 10 mmól metilén-kéket, 50 mmól kálium-dihidrogén-foszfátot, 2,5 mmól magnézium-dihidrogén-foszfátot, 2,5 mmól magnézium-kloridot és a pH 5,6-os értékre való állításához szükséges mennyiségű kálium-hidroxidot tartalmaz. 3. Eljárás HU DNA-t tartalmazó sejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy hup gént tartalmazó baktérium törzset termelünk és a törzs sejtjeiből elkülönítjük a DNA-t, a DNA fragmenteket replikonokhoz kötve rekombinánsokat állítunk elő, a rekombinánsokat recipiens törzs sejtjeibe juttatjuk be, azonosítjuk a recipiens törzs HU DNA-t tartalmazó mintáit és elkülönítjük a HU DNA-t tartalmazó mintákként azonosított, bejuttatott HU DNA-t tartalmazó sejteket. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy replikonokként olyan replikonokat alkalmazunk, amelyek képesek a Rhizobium faj Hup törzsében fennmaradni, recipiens törzsként egy Rhizobium faj Hup törzsét alkalmazzuk, az azonosítást úgy végezzük, hogy megfigyeljük, a recipiens törzs mely mintái alakultak át Hup + -vá és az elkülönítés során az átalakult mintákat különítjük el. 15 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a replikont elkülönítjük az izolált minta sejtjéből és bejuttatjuk egy másik minta baktérium sejtjébe 6. Eljárás Hup+ sejtek előállítására, azzal jellemez- 20 ve, hogy aktív hidrogén-oxidáló rendszerrel nem rendelkező Rhizobium fajhoz tartozó törzs szabadon élő sejtjeibe pHUl vagy pHU2 kozmidot juttatunk. 7. Eljárás a mezőgazdaságban inokulumként használható sejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy 25 bejuttatott HU DNA-t tartalmazó, Hup+ fenotípusú sejteket állitunk elő és a sejteket a sejtszaporodást elősegítő körülmények között tenyésztjük. 8. Eljárás nitrogén kötés fokozására normális kö- 30 rülmények között aktív hidrogén oxidáló rendszerrel nem rendelkező, nitrogén-kötő baktériumokat hordozó hüvelyes növényekben, azzal jellemezve, hogy a Leguminosae faj növényét a 7. igénypont szerinti eljárással előállított Hup+ sejteket tartalmazó inokulum- 35 mai inokuláljuk. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Hup+ sejtek a Rhizobium japonicum faj sejtjei és a Leguminosae faj Glycine max. 10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 40 hogy a Hup+ sejteket pHUl és pHU2 kozmidnak aktív hidrogén oxidáló rendszerrel nem rendelkező Rhizobium fajhoz tartozó törzs szabadon élő sejtjeibe való bejuttatásával állítjuk elő. Rajz nélkü: 9
