191473. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-lipoproteinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 19 i 473 2 5—10 mf c/u-s frakciókban 1—3 cm széles, 18-40 cm magas oszlopra vittük fel. Két fehérje-csúcsot nyertünk, az elsőt 100-300 mcg/ml-nél, a másodikat 20- 150 meg/ ml-nél. A pigmentképző aktivitás ez utóbbi frakció esetén volt pozitív, mégpedig 10 — 20 nappal azután, hogy a tengerimalac bőrét kezeltük. 2. példa Emberi méhlepényeket - 10 °C és 5 °C közötti hőmérsékleten tároltunk 7—15 napig. A méhlepényeket felolvasztottuk és a cotyledokat elválasztottuk a magzatburoktól és a köldökzsinórtól. A méhlepény cotyledokat desztillált vízzel vagy nátriumklorid-oldattal (9 g x 100 ml desztillált víz) mostuk, míg a vérnyomokat eltávolítottuk. A cotyiedokat lemértük és 30- 100 g cotyledo/100 ml etanol mennyiségben 95 %-os etanollal kevertük öszsze. A keveréket 8-40 órán át állni hagytuk, majd szűrtük és a szűrletet 13 — 30 órán át hagytuk ülepedni. A szürlet leülepedése után 50 — 200 ml felülúszóhoz 5 — 20 ml etanolt adtunk, amelyet előzőleg benzoesavval telítettünk. A benzoesavvai telített etanol alkalmazása elősegíti a hatóanyagnak a benzoesav-kristályokon való adszorpcióját. A kapott elegyet 50 percig kevertük, vákuumban szűrtük, a felülúszót félretettük, a kivált csapadékot összegyűjtöttük és 200 —500 ml benzoesavval telített desztillált vízzel mostuk. Az így kapott csapadékhoz 100-300 ml acetont adtunk és a kapott anyagot 1500 ford/perc sebességnél 40 percig centrifugáltuk. A felülúszót félretettük és a csapadékot ismét 100 — 200 ml acetonnal mostuk. Szárítás után a csapadékot 95 %-os etanolban oldottuk, 1 — 10 mg/ml koncentrátumban. 5 - 30 ml előzőek szerint kapott etanolos oldatot 5 x 10“'- 5 x I0“5 mólos nátriumfoszfát pufTer segítségével 3-8 pH-értékre beállított Sephadex G-50 vagy G-80 gélen szűrtük. A szűrésnél 18 — 40 cm magas, 1 — 3 cm átmérőjű üvegoszlopot használtunk. Az oldatot 10 — 30 csepp/perc sebességgel engedtük át az oszlopon és 5 — 10 ml-enként összegyűjtöttük. A frakciók spektrofotometriai analízise során a 20 — 150 mcg/ml értéknek megfelelő 278 nm-nél maximumot mutatott. A frakció liofilizálásával nyert termék etilalkoholos oldata pigmentképző aktivitást mutatott. A proteinek festésére szolgáló festékkel (black amido) megfestett poliakrilamin gélben végzett elektroforézis során kis színes csík volt megfigyelhető a színtelen sáv mellett, mindkettő kismértékű elektroforetikus migrációt jelez. A lipidek festésére szolgáló festékkel (Sudan III) festett agaróz-géllel végzett elektroforézis során csak egy csík volt megfigyelhető azon a területen, ahol az alfa-lipoproteinek szoktak megjelenni. \z általunk izolált alfa-lipoprotein kis molekulasúlyú, molekulasúlya 4000— 1500 dalton. A találmány szerinti készítmény hatékonyságát a Calixto Garcia Hospital (Havanna City) bőrgyógy íszati osztályának 200 férfi- és nőbetegén végzett klinikai vizsgálatok bizonyítják. E betegeken a vitiligo, a jellemző lézióik voltak, melyek szétszórtan vagy lokaiizáltan fordultak elő testükön, különböző méretekben. Koruk 2-64 év közötti volt és kísérletünk megkezdésekor nem álltak semmiféle kezelés alatt. Az alábbi táblázat a 4 év és 2 hónap alatt a ta'álmány használatával nyert latja össze: eredményeket fog összes beteg 200 100 % Összes repigmentált beteg Összes teljesen 168 84 % repigmentált beteg összes részben 63 31,5 % repigmentált beteg Összes nem 105 52,5 % repigmentált beteg 5 2,5 % A kezelést abbahagyó betegek 27 13,5 % Nem léptek fel sem helyi, sem szisztémás másodlagos reakciók. Kezelés utáni récidiva (visszaesés) nem fordult elő. A bazális membrán szövettani vizsgálata során bebizonyosodott, hogy készítményünk a melanin szintézisét idézi elő, és ezáltal kiküszöböli a betegségre jellemző, a bazális membrán melaninjának h ánya által okozott zavart. Az említett szövettani vizsgálatot a Calixto Garda Hospital kórbonctani részlege végezte. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás spektrofotometriás analízis alapján 20—150 mcg/ml protein-csúcsot felmutató alfalipoprotein előállítására, azzal jellemezve, hogy emberi méhlepény cotyledokat 95 %-os etilalkohollal - előnyösen 1 - 10 szeres mennyiségű 95 %-os etilalkohollal, szobahőmérsékleten - extraháljuk, az extraktumot benzoesavval kezeljük, majd Sephadex gélen való szűrés után az alfa-lipoproteint tartalmazó frakciót liofilizáljuk. 2. Eljárás a bőr melanin szintézisének stimulánsára szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított alfa-lipoproteint szokásos hordozóanyagokkal - előnyösen 95 %-os etilalkohollal - helyi használatra alkalmas gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ábra nélkül
