191263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hasnyálmirigy-eredetű, növekedési hormon kibocsátását elősegítő faktor előállítására
1 Í91 263 2 mástól függetlenül ellenőriztünk a tisztaságra, CH3CN gradienst alkalmazunk 0,1 %-os TFA-ban. A központi kivágatot azután liofilizáljuk a kívánt peptid kinyerése érdekében, amelynek tisztasága nagyobb lehet, mint 98 %. Kitermelés: 123 mg. [«](": -55,7°(C = 1 %, ecetsav). A szintézist meg lehet ismételni klór-metilezett gyantát alkalmazva [D-Aía15]-hPGRF(1 -40)-OH előállítása érdekében, ahogyan ezt Rivier, J. leírta [J. Amer. Chem. Soc. 96, 2986-2992 (1974)], Kitermelés: 132 mg, [afD°: — 55,5° (C = 1 %, ecetsav). 2. példa A [D-AIa15]-hPGRF(l-32)-NH2 - amelynek képlete H - Tyr - Ala - Asp - Alá - He - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Val - Leu - D - Ala- Gin - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin- Asp - Ile - Met - Ser - Arg - Gin - Gin - Gly - NH2 - szintézisét lépésenként! módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesizer! használva, MBHA gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. Kitermelés: 149 mg. A pepiidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva. [a]p : 57,9° (C = 1 %, ecetsav). 3. példa A ]D-Alai5]-hPGRF(l-39)-NH2 - amelynek képlete H - Tyr - Ala - Asp - Alá - íle - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Val - Leu - D - Ala- Gin - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin- Asp - Ile - Met - Ser - Arg - Gin - Gin - Gly - Glu - Ser - Asn - Gin - Glu - Arg - Gly - NH2 — szintézisét lépésenként módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesizert használva, MBHA gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. Kitermelés: 107 mg. A pepiidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel. [a]^ : 56,3° (C = 1 %, ecetsav). A szintézist kivitelezhetjük azonos módon, de klórmetilezett gyantát használva, ilyen módon azo-, nos pepiidet állítunk elő szabad sav formájában, ahogyan ezt már általános formában korábban jeleztük. Az 1. példa szerint előállított két szintetikus pepiidet in vitro mérésben összehasonlítjuk tisztított natív hPGRF-el, és a GH kiválasztásában ahhoz hasonló aktivitásúnak találtuk. A különböző szintetikus peptidek növekedési hormon kibocsátását elősegítő hatásának meghatározására in vitro méréseket hajtunk végre, szintetikus hPGRF(l-40)-OH-t alkalmazva standardként (mive! ez ekvivalens a natív pepiiddel), egymás melletti összehasonlításban a különböző más szintetizált analógok és fragmensek ekvimoláris koncentrációival. Olyan tenyészeteket használunk, amelyek magukban foglalnak 4-5 nappal korábban eltávolított patkány-agyalapi mirigy sejteket. Olyan tenyészeteket használunk az összehasonlító vizsgálathoz, amelyeket optimálisnak tekintünk a növekedési hormon kibocsátása szempontjából. Az összehasonlító vizsgálatokat Vale és munkatársai módszerével végezzük (Endocrinology, 91, 562-572 (1972)]. Az inkubálást a vizsgálandó vegyülettel 3 — 4 órán át végezzük, és a tenyészetből alikvotokat veszünk, amelyeknek megmérjük immunoreaktív GH (ír GH) tartalmát. A mérés módszere a jól ismert radioimmunassay. Ennek az összehasonlító vizsgálatnak az eredményeit (ekvimoláris koncentrációkat összehasonlítva) az I. táblázatban mutatjuk be. I. táblázat -, Peptid összehasonlítás, % 100 hPGRF(l -40)-OH (standard ehhez a vizsgálathoz) hPGRF( 1 -4Ó)-NH2 110 hPGRF(l-32)-NH2 140 hPGRF(l-29)-NH2 230 hPGRF(l-29)-OH 29 hPGRF( 1 -27)-NH2 20 Ezeknek a szintetikus peptideknek in vitro vizsgálata azt mutatja, hogy az EC50 20- 100 pikomól között van és a legkisebb hatásos koncentráció 3 — 8 pikomólos. A maximális hatásos koncentráció hPGRF(l-40)-NH2-re kb. 1 nanomólos. Az in vitro vizsgálatokon kívül a növekedési hormon kiválasztásokra in vivo kísérleteket is folytatunk a szintetikus peptid injekciózásával egy beépített katéteren át szabadon futkározó normális hím patkányokba. Az állatokat előkezeljük FLA-63-al, vagyis egy dopamin hidroxiláz inhibitorral, amely visszaszorítja a spontán GH kiválasztást anélkül, hogy az exogén GRF-re adott válaszra hatna. Vérmintákat veszünk ugyanazon a katéteren keresztül közvetlenül az injekciózás előtt, Valamint 5 és 20 perced az injekciók után; a GH szintet a vérben radioimmunassayval mérjük. Az eredmények azt mutatják, hogy a szintetikus hPGRF(l-40)-NH2 és más analógok is hatásos stimulátorai az agyalapi mirigy-eredetű GH kiválasztásának. A testsúly kgonkénti 40 nanogram és 25 mikrogram közti menynyiségeket találtuk hatásos dózisnak, A további vizsgálatok azt mutatják, hogy a szintetikus hPGRF analógok, amelyeket az I., 2., 3. példák szerint szintetizáltunk, a hPGRF(!-40)-ÖH teljes belső biológiai aktivitását mutatják. A szintetikus hPGRF peptidek hasznosak lehetnek olyan esetekben, amelyekben egy orvos növelni szeretné a GH termelést. ÁGH kiválasztás stimulálása ilyen hPGRF peptidekkel fontos lehet olyan pacienseknél, akik az endogén GRF csökkentett termelése által okozott teljes vagy viszonylagos GH hiányban szenvednek. Ezen túl megnövekedett GH D 10 1b 20 2E-30 35 40 45 50 55 60 65 6
