191263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hasnyálmirigy-eredetű, növekedési hormon kibocsátását elősegítő faktor előállítására
1 191 263 2 A peptidek szintézisénél felhasználandó, megfelelő oldalláncot védő csoport kiválasztásánál a következő szabályokat kell követni: (1) a védőcsoportnak meg kell tartania védő tulajdonságait és nem szabad lehasadnia az összekapcsolások körülményei között (2) a védőcsoport legyen stabil az egyes reagensekre, és Xan kivételével, legyen stabil az ct-amino védőcsoport eltávolításához kiválasztott reakciókörülmények között a szintézis minden lépésénél és (3) az oldalláncot védő csoport legyen eltávolítható a szintézis teljessé tétele után (vagyis amikor a kívánt aminosav-szekvencia kialakult) olyan körülmények között, amelyek nem változtatják meg a peptid-láncot. A peptideket előnyösen szilárd fázisú szintézissel készítjük, ahogyan ezt Merrifield leírta [7. Am. Chem. Soc.. 85, 2145. (1963)]. A szilárd fázisú szintézis a peptid C-terminális végéről kezdődik egy védett a-aminosav kapcsolásával a megfelelő gyantához. Ilyen kiindulási anyagot a 40 tagú pepiidhez lehet készíteni az a-amino-csoporton védett Alá kapcsolásával egy észter-kötés útján egy klór-metilezett gyantához vagy egy hidroxi-metil gyantához, vagy egy amid-kötés útján BHA vagy MBHA gyantához. A BHA és MBHA gyanták a kereskedelmi forgalomban kaphatók, és általában akkor használatosak, amikor a szintetizálni kívánt polipeptid helyettesítetlen amidcsoportot tartalmaz a C-terminálison. Ha metil-, etil- vagy propil-amid építendő be a készítendő polipeptídbe, klór-metiíe-; zett vagy hidroximetil gyantát használunk, és a hasítást alkalmas módon a megfelelő amin, pl. etil-amin alkalmazásával hajtjuk végre. A BOC-vel védett Ala a klór-metilezett gyantához Monahan és Gilon módszere szerint kapcsolható (Biopolimer, 12, 2513— 19, 1973). A BOC-Ala kapcsolását követően a gyantához, az a-aminocsoportot védő csoportot eltávolítjuk metilén-kloridos közegben trifluor-ecetsavval (TFA), vagy csak TFA-val, vagy dioxános közegben sósavval. A védőcsoport eltávolítását 0 °C és szobahőmérséklet között kell végrehajtani. Egyéb szokásos hasító reagensek és körülmények is használhatók az egyes a-aminocsoportokat védő csoportok eltávolítására, amint ezeket Schröder és Lubke leírták [The Peptides, 1, 72-75 (Academic Press 1965)]. A Phe a-amino csoportját védő csoport eltávolítása után a többi a-aminocsoportban és oldalláncban védett csoporttal rendelkező aminosavat lépésenként kapcsoljuk össze a kívánt sorrendben; az egyes aminosavak egyenkénti adagolásának alternatívájaként alkalmazhatunk olyan módszert is, amelyben néhány aminosavat egymáshoz kapcsolunk még a szilárd fázisú reaktorba történő adagoláselőtt. A megfelelő kapcsoló reagens kiválasztása a szakterületen jártassághoz tartozik. Különösen alkalmas kapcsoló reagens az N, N’-diciklohexilkarbodiimid (DCCI). A peptidek szilárd fázisú szintézisében alkalmazott aktiváló reagensek jól ismertek a peptidkészítés gyakorlatában. A megfelelő aktiváló reagensekre a példák a karbodiimidek, mint pl. az N, N’diízopropil-karbodiimid, N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)karbodiimid. Más aktiváló reagenseket és alkalmazásukat a kapcsolási reakciókban is leírták Schröder és Lubke a korábban idézett mü III. fejezetében, valamint Kapoor a [Pharm. Sei. 59, 1-27 (1970)] irodalmi helyen. Minden védett aminosavat vagy aminosav-szekvenciát négyszeres vagy nagyobb fölöslegben adagolunk a szilárd fázisú reaktorba, és a kapcsolást dimetil-formamid (DMF): CH2C12 (1:1) közegben hajtjuk végre, vagy csak DMF-ben, ill. csak CH2Cl2-ben. Abban az esetben, ha a kapcsolás nem megy végbe tökéletesen, a kapcsolási eljárást még egyszer el kell végezni az a-aminocsoportot védő csoport eltávolítása előtt, amely megelőzi a következő aminosav kapcsolását. A kapcsolási reakció sikerét a szintézis minden stádiumában ninhidrinreakcióval kell ellenőrizni, ahogyán ezt E. Kaiser és munkatársai leírták [Anal. Biochem. 34, 595 (1970)]. Miután a kívánt aminosav-szekvencia teljessé vált, köztes peptid-terméket el kell távolítani a gyantáról, pl. folyékony hidrogén-fluoriddal, amely nem csupán lehasítja a pepiidet a gyantáról, hanem lehasítja az összes megmaradt, oldalláncot védő X2, X3, X4, X5, X6 és X7 csoportot, az X8 rögzítő kötést, és az X1 a-aminocsoportot védő csoportot, így nyerjük a pepiidet szabad sav formájában. Amennyiben pl. etil-amid előállítása lenne szükséges, a peptidet száraz etil-aminos kezeléssel lehet hasítani. Mivel Met is van jelen a szekvenciában, előnyös először a BOC védőcsoportot lehasítani trifluorecetsav (TFA) és etán-ditiol elegyével, mielőtt még a peptidet lehasítanánk a gyantáról HF-el, ilyen módon elkerüljük a lehetséges S-alkilezést, Amikor HF-et alkalmazunk a hasításhoz, anizolt és metil-etil szulfidot is teszünk a reakcióedénybe átöblítés céljából. A következő példákban bemutatjuk a hPGRF szintézisét szilárd fázisú technikával. A rövidebb peptid fragmensek szintézisét azonos módszerrel hajtjuk végre, csupán elhagyjuk a kívánt mennyiségű aminosavat a lánc valamelyik végénél, azt azonban tudni kell, hogy a biológiailag aktív fragmenseknek tartalmazniok kell az aktivitáshoz szükséges szekvenciát az N-terminálisnál. 1. példa A [D-Ala15]-hPGRF(l-40)-NH2 - amelynek képlete H - Tyr - Ala - Asp - Ala - lie - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Val - Leu - D - Ala- Gin - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin- Asp - Ile - Met - Ser - Arg - Gin'- Gin - Gly - Glu - Ser - Asn - Gin - Glu - Arg - Gly - Ala - NH2-szintézisét lépésenként hajtjuk végre, Beckman 990 peptid-szintetizátort használva MBHA (p-metilbenzhidrilamin hidroklorid-gyantán, amely a Bachem, Inc.-tői kapható, és emylenk helyettesíthetősége 0,1 -0,5 mmól/g gyanta között van. A BOCAla kapcsolását a gyantához az alábbiakban, az „A” és „B” táblázatban leírt általános eljárás szerint végezzük, amelyet végig a szintézis során hasz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
