191263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hasnyálmirigy-eredetű, növekedési hormon kibocsátását elősegítő faktor előállítására
1 191 263 2 A találmány tárgya eljárás olyan új peptidek előállítására, amelyek befolyást gyakorolnak az agyalapi mirigy funkciójára az emberben és állatokban, főleg emlősökben. A peptid elősegíti az agyalapi mirigyből a növekedési hormon kibocsátását. A fiziológusok már régen felismerték, hogy a hipotalamusz szabályozza az adenohipoflzis összes kiválasztási funkcióját oly módon, hogy a hipotalamusz speciális polipeptideket hoz létre, amelyek előidézik az egyes agyalapi mirigy hormonok kiválasztását. Egy inhibitor faktort is azonosítottak, az un. szomatosztatint, amely gátolja a növekedési hormon (GH) kiválasztását. ~ Kutatás folyt egy megfelelő hipotalamusz-eredetű, agyalapú mirigy GH kibocsátását elősegítő faktor felderítése érdekében, és 1982-ben humán hasnyálmirigy tumor kivonatából egy olyan polipeptidet izoláltak, tisztítottak, jellemeztek, majd szintetizáltak és vizsgáltak meg, amely elősegítette az agyalapi mirigy GH kibocsátását. Ennek a 40 tagú pepiidnek a képlete a következő: H - Tyr - Ala - Asp - Alá - Ile - Phe - Thr - Asn- Ser - Tyr - Arg - Lys - Val - Leu - Gly - Gin - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - Ile- Met - Ser - Arg - Gin - Gin - Gly - Glu - Ser - Asn - Gin - Glu - Arg - Gly - Ala - OH. A peptridre ez után mint hPGRF-re hivatkozunk (emberi hasnyálmirigy tumor GH kibocsátó faktor). Ennek a pepiidnek egy 44 tagú, amidált változatát izolálták egy másik tumorból, amely Arg-Ala-Arg-Leu-t foglalt magában a C-termináíison. Úgy találtuk, hogy a hPGRF szintetikus peptid analógja, amelyben a 15. helyzetben a glicin-maradékot D-Ala helyettesíti, teljes, valódi biológiai aktivitást mutat, ugyanakkor a testben az enzimes bomlásnak fokozottan ellenáll, igy meghosszabbított időtartamú biológiai hatása van. Ezen túi meglepő módon azt találtuk, hogy az amidált C-terminálist tartalmazó 1 — 29 és í - 32 hPGRF-fragmensek olyan biológiai potenciált mutatnak, amely azonos a natív, 40 aminosavból álló peptid potenciáljával. A találmány tárgya továbbá eljárás olyan gyógyászati készítmények előállítására, amelyek hPGRF-et, vagy biológiailag aktív amidált fragmensét tartalmazzák, vagy a fentiek bármilyen nem toxikus sóját, gyógyszerészeti leg elfogadható folyadékban vagy szilárd hordozóban diszpergálva. Az ilyen gyógyászati kompozíciókat mind g humán, mind az állatgyógyászatban lehet alkalmazni klinikai gyógyításban terápiás adagoláshoz és diagnosztikai célra egyaránt. A következőkben a találmány előnyös megvalósítását ismertetjük. A peptidek meghatározásánál Schröder és Lubke nomenklatúráját alkalmazzuk. [„The Peptides”, Academic Press (1965)], ahol a hagyományos ábrázolásnak megfelelően az aminocsoport az N-terminálisnál a bal oldalon van feltüntetve és a karboxilcsoport a C-terminálisnál a jobb oldalon. Ahol az aminosav-maradékoknak izomer formái vannak, a képletben mindig az amiaosav L-formája értendő, hacsak határozottan másképpen nem jelöljük. A találmány szerinti eljárással az (I) általános képletű hPGRF peptideket lehet előállítani : H - Tyr - Ala - Asp - Alá - He - Phe - Thr - Asn- Ser - Tyr - Arg - Lys - Val - Leu - D - Ala - Gin Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp- Ile - Met - Ser - Arg - Gin - Gin - Gly - Q„ - Y (I) ahol 3 jelentése Glu, Glu-Ser, Glu-Ser-Asn, Glu-Ser- Asn-Gln, Glu-Ser-Asn-Gln-Glu, Glu-Ser- Asn-Gln-Glu-Arg, Glu-Ser-Asn-Gln-Glu- Arg-Gly, Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala, n értéke 0 vagy 1, Y jelentése -OH vagy -NH2. A peptideket bármilyen alkalmas módszerekkel lehet szintetizálni, így pl. kizárólagosan szilárd fázi; ú technikákkal, részlegesen szilárd fázisú technikákkal, fragmenskondenzáciéval, klasszikus, oldatban történő kapcsolásokkal. A kizárólagosan szilárd fázisú technikát például a „Solid-Phase Peptide Synthesis” (Szilárd fázisú peptid szintézis) című szakkönyv (Stewart és Young szerkesztése, Freeman és Co. kiadás, San Francisco, 1969), és a 4 105 603 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás leíró részében ismerteti (Vale és munkatársai, 1978. aug. 8.). A fragmens-kondenzációs módszert a 3 972 859 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás részletesen ismerteti (1976. aug. 3.). Egyéb alkalmas szintézis módszereket ismertet a 3 842 067 (1974. okt. 15.) és 3 862 925 ? 1975. jan. 28.) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. A találmány szerinti peptidek előállítására alkalmas rekombináns DNS technikák alkalmazásával történő szintézis (amely módszer nem képezi találmányunk tárgyát) értelemszerűen magában foglalja a hpGRF fragmens kívánt formáját kódoló struktúrgén megfelelő alkalmazását. A szintetikus íPGRF fragmenst úgy nyerhetjük, hogy egy ilyen struktúrgénnel együttműködő promotort és operátort magában foglaló kifejeződést előidéző (expessziós) vektort alkalmazva egy mikroorganizmust transzformálunk, és így előidézzük, hogy egy lyen transzformált mikroorganizmus kifejezze a hPGRF fragmenst. Egy állatot (embert nem) színén lehet használni hPGRF előállításához géntelyésztéssel, egy ilyen struktúrgént és általános eljáást ismertet a 4 276 282 (1981. június 30.) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, vagy az embriók mikroinjekciózását ismerteti a WO 83/01783 nemzetközi közzétételi számú PCT bejelentés (publikálva 1983. május 26.) és a WO 32/04443 nemzetközi közzétételi számú PCT-beje:entés (publikálva 1982. december 23.). A szintetikus hPGRF fragmenst közvetlenül abban az állatban is elő lehet állítani, amelynek növekedését fokozni kívánjuk. Ezt a módszert is ismerteti a két említett PCT-bejelentés. A kémiai kapcsolásos szintézisekben szokásos módszer az, hogy az aminosav-maradékok oldalláncaiban levő, könnyen reakcióba lépő csoporto-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
