191134. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hőálló alfa-amiláz enzim előállítására
1 191 134 2 A találmány tárgya eljárás hőstabil alfa-amiláz enzim előállítására. Az alfa-amilázok jól ismert enzimek, amelyeket a kereskedelemben kapható tisztítószerek előállítására, valamint a keményítőnek vízben oldható szénhidrátokká való átalakításához használnak, ezen enzimek különösen alkalmasak a keményítőnek kémiai vagy enzimatikus úton glükózzá, egy, a kereskedelemben jól értékesíthető termékké való átalakítására. Az amiláz enzimeket korábban mikrobiológiai eljárásokkal állították elő, például Bacillus-fajhoz tartozó törzsek tenyésztése útján. Az 1 296 839. számú brit szabadalmi leírás ismerteti a hőstabil alfa-amiláz előállításának egy olyan módszerét, amelynek során e terméket a Bacillus licheniformis tenyésztése útján állítják elő. Az így kapott enzim höstabilitása sokkal nagyobb, mint a Bacillus subtilis törzsek tenyésztése útján nyert készítményé, de az említett brit szabadalmi leírásban megadott enzimaktivitás-értékek nem magasak, s ezért ez az eljárás a hőstabil amiláz enzim ipari előállítása szempontjából nem kielégítő. Azt tapasztaltuk, hogy a Bacillus licheniformis egyik törzse különösen alkalmas a höstabil alfaamiláz enzim ipari méretű termelésére, ugyanis ezzel a törzzsel az enzimet magas kitermeléssel lehet előállítani. A Bacillus licheniformis ezen törzsével általában legalább körülbelül tízszer nagyobb kitermelési lehet elérni, mint az említett brit szabadalmi leírásban ismertetett módszerrel. E mikroorganizmus életképes tenyészetét letétbe helyeztük az Amerikai Típustenyészetek Gyűjteményében (American Type Culture Collection), ahol e mikroorganizmust az ATCC 39 326 jelzéssel jegyezték be. A jelen találmány szerinti eljárással előállított alfaamiláz enzim höstabilitása ugyanolyan nagyságrendű, mint az 1 296 839. számú brit szabadalmi leírásban ismertetett eljárással előállított hasonló készítményé, az enzim továbbá kalcium-ionokat megkötő szerek nagy koncentrációjának jelenlétében is viszonylag stabil. A jelen találmány szerinti eljárással előállított enzimnek megvan valamennyi, az említett brit szabadalmi leírásban megadott előnyös tulajdonsága, és ezenkívül magas kitermeléssel lehet előállítani. A jelen találmány szerinti eljárás kívánatos eredményeit úgy érhetjük el, hogy a megadott Bacillus licheniformis törzset egy alkalmas táptalajban, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű enzim fel nem halmozódik. A fermentációt általában 2-6 napig, 25 ”C és 55 °C közötti hőmérsékleten végezzük, és ennek során a szakemberek előtt jól ismert szokásos, felhasználható szén- és nitrogénforrásokat, valamint más lényeges tápanyagokat használunk. Alkalmas szénforrások például a szénhidrátok, laktóz, glükóz és a keményítő, továbbá a szénhidrátot tartalmazó anyagok, mint például a szója, kukoricaliszt, valamint.ezek keverékei. A szénhidrát mennyisége széles határok között változhat, például I vegyes% és 25 vegyes % között, és előnyösen 5—15 vegyes % között van. A találmány szerinti eljárás legelőnyösebb változata szerint szénforrásként laktózt használunk, ugyanis így kaphatjuk az enzimet a legmagasabb kitermeléssel. A laktóz mennyisége a táptalajban általában 1 -20 vegyes% között, és előnyösen 5-15 vegyes% között van. Szénforrásként használhatjuk a laktózt önmagában, vagy pedig más szénforrásokkal együtt, például tejsavóval vagy szójaliszttel együtt, ahol ez utóbbi mennyisége általában nem nagyobb, mint 5 vegyes %. Nitrogénforrásként használhatunk szerves vagy szervetlen vegyületeket, például oldható nitrátokat vagy ammónium-sókat. A szerves nitrogénforrásek például az élesztőkivonat, kukoricalekvár, földimogyoró-liszt. Az említett mikroorganizmust a táptalajban süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztjük, e célból a fermentációs edényt levegőztetjük, mégpedig általában percenként a táptalaj térfogategységére számított körülbelül egy térfogatnyi levegővel. Miután megállapítottuk, hogy a táptalajban a kívánt mennyiségű enzim felhalmozódott, az enzimet elkülönítjük a közegből. Az elkülönítés módszerei a szakemberek előtt ismeretesek, ilyen módszerek például az enzimnek ismert kicsapószerekkel, mint például nátrium-szulfáttal, vagy pedig vízzel elegyíthető szerves oldószerekkel, mint például acetonnal vagy etanollal végzett kicsapása A kicsapott anyagot centrifugáljuk vagy kiszűrjük, és megszárítjuk, ily módon tisztított, szilárd formájú enzimet kapunk. A fentiekben említett mikroorganizmus alkalmazásán kívül a jelen találmány oltalmi körébe beletartozik e mikroorganizmus mutánsainak és változatainak, valamint olyan, genetikailag átalakított változatainak alkalmazása is, amelyeket az enzim génjeinek az említett mikroorganizmusokba való bevitele útján kaphatunk. A jelen találmány szerinti eljárást az alábbiakban, a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül, példával szemléltetjük. A példákban szereplő 96-ok tömeg%-ot jelentenek. 1. példa a) lépés A Bacillus licheniformis ATCC 39326 Difco keményítős agarral készült ferdeagaros tenyészetét egy Difco keményítős agar lemezre szélesztjük, és 40 °C± 1 'C hőmérsékleten 18 ± 1 órán át tenyésztjük. b ) lépés A sejtek egy kacsnyi mennyiségét az alábbi összetételű táptalajra oltjuk át: Vizes inokulum (átoltó) táptalaj tömeg% Élesztőkivonat 0,5 % Tripton (tripszinnel hidrolizált kazein) 0,5 % Dikálium-hidrogén-foszfát 0,1 % D-Glükóz 0,1 % Egy 1 liter térfogatú lombikba 350 ml ilyen táptalajt teszünk. A lombikot 1-2 napig 40 °C± 1 °C hőmérsékleten, percenkénti 200-as fordulatszámmal egy New Brunswick G - 50 rázókészüléken rázatjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
