191085. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-(5'-ribonuleotid)-származékok előállítására
9 191 085 10 Zóna (S. lutea-ra A frakció sorszáma érzékeny) (mm)-E . + E 126 20,5 56 129 20 55 132 20,5 55 135 21 55 138 21 54 141 20 54 •144 20,5 54 147 21 54 150 23 54 153 21,5 52 A frakció sorszáma Zóna (S. lutea-ra érzékeny) (nun)-E +E 156 20 53 159 20 54 162 20 54,5 165 20 54,5 168 21 55 171 22 55 174 22,5 54 177 23 54 180 24 54 183 24 54 186 0 46,5 A 24 23 B 15 28 C 20 44 D 22 23 E 22 24 A következő gyűjtéseket végeztük: I. Gyűjtés 34- 48 frakciók, 280 ml (ADA-69B) II. Gyűjtés 75- 90 frakciók, 330 ml (ADÄ-69C) III. Gyűjtés 101-111 frakciók, 180 ml (ADA-69D) IV. Gyűjtés 114-150 frakciók, 580 ml (ADA-69E) V. Gyűj tés 151-164 frakciók, 100 ml (ADA-69F) VI. Gyűjtés 165-186 frakciók, 125 ml (ADA-69G) VII. Gyűjtés C frakció, 1 liter (ADA-69A) Az I. gyűjtés (ADA-69B) változatlan U-57 930 vegyiiletet tartalmaz, ezért elvetjük. Az A-.E frakciók közül csak a C frakciót tartjuk meg, a többit elvetjük. A II. gyűjtés (ADA-69C) egy ismeretlen anyagot tartalmaz, mely alkálikus foszfatázzal kezelve U-57 930-at ad. UV: Xmax 275 nm. A Ifi. gyűjtés (ADA-69D) 3-(citidin-5’-foszfát)U-57 930-al tartalmaz, és ezt az alább leírt módon kezeljük. UV: Xma?c 270 nm. A IV. gyűjtés (ADA-69E) 3-(adenozin-5'-foszfát)U-57 930-at tartalmaz, ezt az alább leírt módon kezeljük. UV: ^max 260 n m. Az V. gyűjtés (ADA-69F) 3-(adenozin-5'-foszfát- U-57 390, 3-(uridin-5'-foszfát)- U-57 930 és 3<guanozin- 5'-foszfát)- U-57 930 keverékét tartalmazza. Ezt az oldatot az alább leírt módon kezeljük. A VI. gyűjtés (ADA-69G) 3-(guanozin-5'-foszfát)U-57 930-at tartalmaz, ezt az alább leírt módon kezeljük. UV: Xmax 254 nm; sh 275-nél. A VII. gyűjtés (ADA-69A) 3-(guanozin-5'-foszfát)U-57 930, 3-(uridin-5'-foszfát)- és U-57 930 keverékét tartalmazza. Ezt az oldatot az alább leírt módon kezeljük. Lényegében tiszta 3-(citidin-5’-foszfát)- U-57 930, 3-(adenozin-5'-foszfát)- U-57 930 és 3-(guanozin-5'-foszfát)- U-57 930 elkülönítése a UL, IV., illetve VI. gyűjtésekből: A THAM-acetát puffer eltávolítása Amberlite XAD-2 kromatográfia segítségével. A III., IV. és VI. gyűjtéseket, melyeket a fentebb leírt módon kaptunk, Amberlite XAD-2-t tartalmazó oszlopokon vezetjük át. A lecsepegő folyadékot elvetjük. \7. oszlopokat átmossuk vízzel, majd metanol és víz 70:30 arányú clegyével eluáljuk. A frakciókat UV segítségével elemezzük, továbbá az alkálikus foszfatázzal való kezelés előtt, és kezelés után a biológiai hatékonyság vizsgálatával. A megfelelő frakciókat egyesítjük, vizes oldattá koncentráljuk, és liofllizáljuk. Az alábbi táblázatban összegezzük az Amberlite XAD-2 minden egyes gyűjtésére használt mennyiségét, a vizes mosófolyadék mennyiségét, a metanolos eluátum és a kapott anyag mennyiségét. Gyűjtés A felhasznált Ambcrlilc XAD-2, ml Vizes mosófolyadék, ml Metanolos cluáíum, ml Elkülönített anyag, ml III. 50 200 300 150 IV. 200 800 600 3510 VI. 50 200 300 470 A III. gyűjtésből kapott anyagot ADA-73.1, a IV. gyűjtésből kapott anyagot ADA-74.1, és a VI. gyűjtésből kapott anyagot ADA-75.I jelzéssel őrizzük. A THAM-acetát puffer eltávolítása az V. gyűjtésből (ÄDA-69F) és a VII. gyűjtésből (ADA-69A) Amberlite XAD-2 kromatográfiával. Az oszlopot 300 ml Amberlite XAD-2 gyantából készítjük. Az oszlopon átvisszük az V. és VII. gyűjtéseket, melyek 3-(adenozin-5'-foszfát)- U-57 930, 3-(uridin- 5' foszfát)- U-57 930 és 3-(guanozin-5'-foszfát)- U-57 930 keverékét tartalmazzák. A lccsepcgő folyadékot eldobjuk. Az oszlopot átmossuk 600 ml vízzel, és a lecsepegő folyadékot szintén elvetjük. Ezután az oszlopot metanol és víz 70-30 arányú elegyével eluáljuk. Azon frakciókat, melyek alkálikus foszfatázzal való kezelés után biológiailag hatásos anyagot adnak egyesítjük, ez 300 ml, melyet vizes oldattá töményílünk és lioOliz.áluuk. így kapjuk az ADA-7I.I jelzésű. 670 mg súlyú készítményt. Az ADA-71.1 jelű készítményt az alábbi leírt módon kezeljük. A 3-(uridin-5'-foszfát)- U-57 930 a 3-(adenozin-5'foszfát)- U-57 930 és 3-(guanozin-5'-foszfát)- U-57 930 elválasztása DEAE-Sephadex kromatográfiával: 600 ml 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
