190999. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-treonint termelő törzsek előállítására
1 2 190 999 módon pYNI plazmidot kúp tunk. Ez a plazmid abban tér el a pEKI plazmidtól, hogy nem tartalmaz kromoszóma-töredéket Hind Hl endonukleáz enzimmel történő két hasítási hely között. A pEKI és a pYNI plazmidok a treonin-operon 5 három génje közül mindössze kettőt tartalmaznak, a thr A és a thr B gént, amint ezt az 1. és 2. ábra szemlélteti. Az 1. ábrán a pEKI plazmid restrikciós rajza látható. A vastagon kihúzott körív a pBR 322 vek- 10 torplazmid-szakasz, a vékony vonallal húzott körív pedig a DNS-kromoszóma klónozott töredékét jelenti. A szaggatott vonal annak a plazmidszakasznak felel meg, amely a pYNI plazmid keletkezésekor el lett távolitva. A nyilak azokat a helyeket 15 mutatják, ahol a plazmidot a különféle endonukleáz enzimek felhasították, a számok pedig a felhasítási pontok közötti szakaszok nagyságát adják meg megadalton egységekben. A nyilakkal ellátott fekete négyszögek a tetraciklinnel (Tc) és penicillinnel 20 (Ap) szemben ellenállást képviselő gének, a replikációs gének (P0) és a treonin-operon promotor- és szerkezeti részeit jelképezik. A 2. ábra a pYNI plazmid restrikciós rajzát szemlélteti. A jelölések megegyeznek az 1. ábrán 25 alkalmazottakkal. Azt tapasztaltuk, hogy a B. coli C600 törzs hibridplazmidjaival végzett transzformáció nem növelte jelentős mértékben a sejtek treonin-szintézisét. 30 Amikor ugyanezt a donortörzset és vektorként a pBR 322 plazmidot alkalmaztuk, a Hind III típusú specifikus endonukleázzal együtt, a pYNII hibridplazmidot kaptuk, amely a treonin-operin mindhá- , rom génjét tartalmazza. 35 A 3. ábrán a pYNII plazmid restrikciós rajzát mutatjuk be. A jelölések azonosak az 1. ábrán használtakkal. A befogadó törzsként alkalmazott Escherichia coli VL334 kapott hibridplazmidjával végzett 40 transzformáció megnövelte a treonintermelést. A fermentálás folyamán az aminosav 4 g/1 koncentrációra dúsul fel a táptalajban. Vizsgálataink tehát azt bizonyítják, hogy a treonintermelés növeléséhez szükség van a treonin-operon mindhárom génjének 45 az amplifikálására. Emellett lehetővé vált az endonukleáz enzimek segítségével az Escherichia coli olyan kromoszóma-töredékének a kiválasztása, amely a treonin-operon valamennyi génjét tartalmazza. 50 A homoszerindehidrogenáz I (a thrA gén terméke) specifikus aktivitásának az Escherichia coli VL334 törzs sejtjeinek extraktumából (pYNII) végzett meghatározása azt mutatta, hogy az több mint 60-szorosa az olyan sejtextraktumokban fennálló 55 enzimaktivitásnak, ahol a sejtek a thrA génnek csak egy másolatát tartalmazzák. Egyidejűleg a treonintermelés mértéke alapján a vad típusú treonin-operont tartalmazó hibridplazmidot hordozó Escherichia coli VL334 (pYNII) törzs csak alig 60 múlja felül a plazmidmentes Escherichia coli VNII- genetika MG442 törzset, amelynek a thrA génjében olyan mutáció található, hogy az gátolja e gén termékeit képező enzimek treoninnal történő alloszterikus gátlását. Feltételeztük, hogy az Escheri- 55 chia coli VL334 (pYNII) törzs sejtjei treonin-szintézisének nem túlságosan magas szintje arra vezethető vissza, hogy a felhalmozódó treonin csökkenti a treonin szintézisét szabályozó enzimek aktivitását. Ezért célszerűnek látszik donortörzsként a treonin-operon klónozásához az Escherichia coli VNIIgenetika MG442 törzs alkalmazása, amelynél zavart a treoninszintézis negatív szabályozása. Ha donortörzsként az Escherichia coli VNIIgenetika MG442 törzset, vektorként pedig a pBR 322 plazmidot használjuk, és a DNS-töredékeket a Hind III endonukleáz enzimmel hozzuk létre, akkor a pYNIO hibridplazmidot kapjuk, amelynek a restrikciós térképe nem tér el a pYNII 3. ábrán bemutatott térképtől. Miután a befogadó Escherichia coli VL334 törzset a pYNIO plazmiddal transzformáltuk, az Escherichia coli VL334 (pYNIO) törzset kaptuk, amely 12-13 g/1 treonint szintetizál. Ennek megfelelően, az aminosavat termelő törzs hibridplazmid segítségével történő előállításához olyan mutációra van szükség a klónozandó DNS- töredéknél, amely zavarja az aminosavszintézis negatív szabályozását. A különböző molekulasúlyú hibridplazmidokkal végzett kísérletek során - az ismert adatokkal összhangban - azt tapasztaltuk, hogy a hibridplazmidok másolatainak száma, a baktériumkromoszómára vonatkoztatva, 10—22 között ingadozik, és a molekulasúlytól függ. Minél kisebb a plazmid molekulasúlya, annál több másolata van jelen a sejtben Másrészt viszont a plazmidban található gének által szabályozott enzimaktivitás egyenes arányban növekszik a plazmid másolatainak számával. Ebben az összefüggésben célszerűnek látszik az illető aminosav szintézisét szabályozó géneket hordozó hibridplazmid nagyságának csökkentése. és a genetikai ballasztanyag eltávolítása. Amikor a hibridplazmidot hordozó sejtek extraktumaiból meghatároztuk a homoszerindehidrogenáz I aktivitását, azt az eredményt kaptuk, hogy a nagy treonin- és izoleucinkoncentrációk (1 n g/ml) harmadára-negyedére csökkentik az enzim aktivitását. Ezt az amplifikált treonin-operon repressziója megnyilvánulásának tekintjük. Ezért ahhoz, hogy a legnagyobb mértékben jusson kifejezésre az amplifikált treonin-operon, célszerűen derepressziós viszonyokat hozunk létre. A befogadó törzsben a derepressziós feltételek a represszor fehérje szintézisét szabályozó gén károsításával vagy a repressziós kofaktor szintézisének megzavarásával hozhatók létre. így például a treonin-operon derepresszióját olyan mutációnak a befogadó törzsbe való bevitelével érhetjük el, amely megzavarja az izoleucin szintézisét. Az izoleucinnak ugyanis szerepe van a treonin-operon represzsziójában. Kiderült, hogy a VL334 befogadó törzsben az izoleucin szintézisét részben blokkoló ilvA mutáció jelenlétében a treoninszintézis a hibridplazmid szabályozásának hatására 4-5-szörösre növekszik. Amint arra már rámutattunk, a VL334 törzs - amelynél a thrC mutáció blokkolja a treonin szintézisét, az ilvA mutáció pedig a treonin metabolizmusán; k szomszédos szakaszát, az izoleucinná való 5
