190973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GRF-analógok előállítására
1 190 973 2 gált anyaggal, a tenyészléből alikvot részeket távolítunk el, majd ezeket feldolgozva mérjük az immunoreaktív GH (ir GH) tartalmat egy jól ismert radioimmunassay módszerrel. Az összehasonlító vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy ekvimoláris mennyiségben a pGRF(l-44)—NH2 rendelkezik a szintetikus hGRF peptid teljes biológiai aktivitásával, és közel ugyanazzal a potenciállal. 3. példa A H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Serr Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg- Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln- Gly-GIu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val- Arg-Leu—NH2 képletü bGRF(l-^14) amidot lépésedként szintetizáljuk Beckman 990 Peptid Szintetizátorral egy MBHA gyantán. A BOC-Leu csoportot a 4 292 313 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt módszerrel kapcsoljuk a gyantához, és ennek eredményeképpen 0,2-0,6 mmól leucin kötődik a gyantára, az alkalmazott MBHA szubsztitúciójától függően. Az összes használt oldószert semleges gáz, előnyösen hélium átbuborékoltatásával gázmentesítjük, ezzel biztosítjuk, hogy ne legyen jelen a metionin kénatomját nemkívánt módon oxidáló oxigén. A védőcsoport eltávolítása és a semlegesítés után a peptidláncot lépésenként építjük fel a gyantán. A védőcsoport eltávolítása, a semlegesítés és az egyes aminosavak hozzáadása lényegében a 3 904 594 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban részletesen közölt módszerrel történik. A kapcsolásokat az 1. példa A ütemterve alapján végezzük. A kapcsolási reakciókat az 1. példában leírt módszerrel hajtjuk végre, és a szintézis végén a következő általános képletü vegyületet kapjuk: X'-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Val-Leu- Gly-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu- Leu-Gln-Asp(X3)-Ile-Met-Asn-Arg(X6)-Gln-Gln- Gly-Glu(X3)-Arg(X6)-Asn-Gln-Glu(X3)-Gln-Gly- Ala-Lys(X7)-Val-Arg(X6)-Leu-X8, ahol X, jelentése BOC, X2 jelentése 2,6-diklór-benzil-csoport, X3 jelentése benzil-észter-csoport, X4 jelentése Bzl, Xs jelentése Bzl, X6 jelentése Tos, X7 jelentése 2 Cl—Z és X8 jelentése —NH—MBHA gyanta hordozó. Miután a befejező tirozin-csoportot a gyantához kapcsoltuk, a BOC-csoportot 45%-os TFA diklórmetános oldatával eltávolítjuk. A védőcsoportok eltávolítására a megmaradó védett peptid-gyanta komplexről, minden gramm gyantára számítva 1,5 ml anizollal, 0,25 ml metiletil-szulfiddal és 10 ml hidrogén-fluoriddal -20 °C-on fél óráig, majd 0°C-on fél óráig kezeljük. Miután a hidrogén-fluoridot nagy vákuumban eltávolítottuk, a gyanta-peptid maradékot felváltva száraz dietil-éterrel és kloroformmal mossuk, majd a peptidet gázmentesített 2 n vizes ecetsavval extraháljuk. Az ecetsavas extraktum liofilezésével fehér, pelyhes anyagot kapunk. A lehasított és védőcsoport-mentesített peptidet ezután 30%-os ecetsavban oldjuk, és Sephadex G-50 (finom) gélen szűrjük. A peptidet ezután tovább tisztítjuk az 1. példában leírt módon, kation-cserélő kromatográflával, majd megoszlásos kromatográfiával. A szintézist klór-metilezett gyantával megismételjük, így a fenti peptidet kapjuk a C-terminális végen szabad savval, általában a [Biopolymers, 12, 2513-19, (1973)]-ben leírt eljárást követve a leucinnak a klór-metilezett gyantához való kötésére. A bGRF(l 44) szabad sav optikai forgatóképessége [a]D = -64± 1° (c = 1,1%-os ecetsavban). A fenti, C-terminális végén szabad savat tartalmazó peptid előállítására klór-metilezett gyantával megismételjük a szintézist, az 1. példa eljárása szerint. 4. példa A peptid növekedési hormon kibocsátására gyakorolt hatásának meghatározására in vitro vizsgálatokat végeztünk a 2. példában leírt módon, közvetlenül összehasonlítva ekvimoláris koncentrációban a szintetikus hGRF(l-44)—NH2-t és a bGRF(l-44)—NH2-t. Az összehasonlító vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy a bGRF(l-44)—NH2-nek azonos a biológiai aktivitása a szintetikus pepiidével, és közel azonos a potenciálja. Többfaktoros kísérleti elrendezésben, több dózisban vizsgálva a bGRF a hGRF(l-44)—NH2-vel azonos aktivitással rendelkezik; fajlagos aktivitása pedig az 54-93% konfidencia tartományon belül 70%-a a hGRF(l-44) —NH2-ének. 5. példa A H-Tyr-AJa-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr- Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys- Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly- Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg- Leu—NH2 képletü oGRF(l-44) amidot lépésenként, Beckmann 990 Peptid Szintetizátort és MBHA gyantát használva szintetizáljuk, a 3. példában leírtak alapján. A szintézis végén az X1- Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn- Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Ile-Leu-Gly-Gln- Leu-Ser(X5)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln- Asp(X3)-Ile-Met-Asn-Arg(Xe)-Gln-Gln-Gly-GIu(X3)-Arg(X6)-Asn-Gln-Glu(X3)-Gln-Gly-Ala-Lys(X7)-Val-Arg(X6)-Leu-X8 általános képletü vegyületet kapjuk, ahol X, jelenése BOC, X2 jelentése 2,6-diklór-benzil-csoport, X3 jelentése benzilészter, X4 jelentése Bzl, X5 jelentése Bzl, X6 jelentése Tos, X7 jelentése 2C1—Z, és X8 jelentése —NH—MBHA gyanta hordozó. Miután az utolsó tirozin-csoportot a gyantához kapcsoltuk, a BOC-csoportot 45%-os TFA diklórmetános oldatával eltávolítjuk. A megmaradó védett peptid-gyanta komplex hasítását és védőcsoport-mentesítését a 3. példában leírt módon végezzük. A hasított és védőcsoport-mentesített peptidet 30%-os ecetsavban oldjuk, Sephadex G-50 (finom) oszlopon gél-szűrjük, az 1. példában leírt módon 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
