190936. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az 5-helyzetben helyettesített 2-amino-1,2,4-triazolo-[1,5-c]-pirimidin-származékok előállítására
5 190.936 6 intradermális oldatok vagy intramuszkuláris készítmények. Végső felhasználási koncentrációjuk 1 PNU/ml nagyságrendű. Emberi vérből a leukocyták elkülönítése és az allergikus reakció kiváltása Anti-IgE, ambrózia-antigén vagy más specifikus allergén hatására ismert módon hisztamint kiválasztó egyénektől 80 ml vért veszünk, négy darab 20-20 mles heparinizált kémcsövet használva a vérvételhez. Ezt a 80 ml vért összekeverjük 20 ml olyan konyhasóoldattal, amely 0,6 g dextrózt és 1,2 g dextránt tartalmaz. A vért ezután szobahőmérsékleten ülepedni hagyjuk két 50 ml-es polikarbonát-centrifugacsőben addig, míg a vörös vértestek és a plazma között éles határfelület alakul ki (ehhez 60-90 percre van szükség). A felső fázist, azaz a plazma fázisát mindegyik centrifugacsőből pipettával eltávolítjuk, majd egyegy 50 ml-es polikarbonát-csőbe töltjük. A plazmát ezután 4 °C-on 8 percen át 110X g értéken centrifugáljuk. A felülúszót a lehető leggondosabban és legteljesebben leöntjük, majd a visszamaradt sejttömeget 2-3 ml Trisz-A pufferben újraszuszpendáljuk szilikonizált Pasteur-pipettát használva. Az újraszuszpendálást úgy végezzük, hogy a pipetta végét a folyadékszint alá süllyesztve a folyadékot gyenge áramban ki-benyomatjuk a pipettába mindaddig, míg a sejtek egyenletes szuszpenziója ki nem alakul. Elegendő mennyiségű Trisz-A puffert adagolunk ezután ahhoz, hogy a csőben a térfogat mintegy 45 ml legyen, majd a csövet 4 °C-on 8 percen át 110X g értéken centrifugáljuk. A felülúszót leöntjük, a visszamaradt sejttömeget pedig az előzőekben ismertetett módon újraszuszpendáljuk és centrifugáljuk. A felülúszót leöntjük, majd a visszamaradt sejttömeget 2-3 ml Trisz-ACM pufferben szuszpendáljuk, olyan térfogatmennyiségű szuszpenziót kapva, mely elegendő a kimutatási reakció végrehajtására szolgáló csövekbe való adagoláshoz. Ilyen kémcsöveket készítünk elő tehát úgy, hogy egy-egy kémcső 0,2 ml össztérfogatban anti-IgE-t vagy antigéneket önmagukban vagy valamely kísérleti vegyülettel együtt tartalmazzon. A kémcsöveket 37 °C-os fürdőbe helyezzük. A sejteket 37 °C-ra melegítjük és gyakran felkeverjük, hogy egyenletes eloszlású szuszpenziót biztosítsunk, A kémcsövekbe 1,0 ml-es aliquotokat adagolunk a sejtszuszpenzióból. A kémcsöveket ezután 60 percen át 37 °C-on inkubáljuk, a kémcsöveket minden 15 percben finoman megforgatjuk, hogy a sejteket egyenletesen szuszpendálva tartsuk. A reakció befejeződése után a kémcsöveket 4 °C-on 10 percen át 1500 fordulat/ perc sebességgel centrifugáljuk a sejtek kiülepítése céljából. A felülúszóból 1 ml-es aliquotokat 12x75 mm méretű polietilén-csövekbe mérünk be, és mindegyik kémcsőbe 0,2 ml 8%-os perklórsavat is adagolunk. Mindegyik kísérletsorozatba vakminták és úgynevezett totálminták is tartoznak. A vakmintáknál a kísérleti elegy tartalmaz sejteket és az összes reagenst, kivéve antigént vagy anti-IgE-t. A totálminták 0,24 ml 8%-os perklórsavat, 1 ml sejtszuszpenziót és 0,2 ml puffert tartalmaznak. Mindegyik vizsgálati mintát végül centrifugálásnak vetjük alá a kicsapódott fehérje eltávolítása céljából. A kiválasztott hisztamin meghatározása automatizált ßuorometriäs módszerrel Ezt az automatizált módszert Siraganian, R. P. ismerteti az AnalBiochem., 57. 383 (1974) és J. Immunoi. Methods., 7. 283 (1975) szakirodalmi helyeken. A módszer a Shore, P. A. és munkatársai által a J. Pharmacol. Exp. Ther.,277. 182(1959) szakirodalmi helyen ismertetett manuális módszeren alapul. Az automatizált, Technicon Autoanalyzer II elnevezésű rendszer a következő részekből áll: mintavevő (IV), kétsebességű adagoló szivattyú (III), „7- 60” jelzésű, szűk átengedőképességű primer szűrővel és „2-74” jelzésű szekunder szűrővel ellátott fluoronefelométer, rögzítő és digitális nyomtató. A kísérleti rendszert a Siraganian által a fenti szakirodalmi publikációkban ismertetett módon működtetjük, a következő módosításokkal: a dializálót elhagyjuk, mindegyik adagolóvezetéket egyetlen nagykapacitású adagoló szivattyún vezetünk át és az analízishez a minta térfogatának kétszeresét vesszük. Az automatizált kémiai meghatározás a következő lépésekből áll: bázikus kémhatású sóoldat extrahálása butanollal, visszaextrahálás híg sósavoldattal heptán adagolása mellett, hisztamin reagáltatása orto-ftáldialdehiddel (OPT) magas pH-értéken és az OPT-addukt átalakítása foszforsavval stabil fluoroforrá. A reakcióterméket ezután a fluorométeren átbocsátjuk. A teljes skálájú méréstartományt úgy állítjuk be, hogy 50 ng hisztamin-bázis legyen mérhető közel 0,5 ng határérzékenység mellett. A kiválasztott hisztamin mérésénél kapott eredmények számítása A készülék vakminta-értékét mindegyik mintánál mért, nanogrammban kifejezett hísztamin-értékből levonjuk (tulajdonképpen így a készülékhibát veszszük figyelembe). Ezután mindegyik minta hisztamin-értékét osztjuk a három totálminta (perklórsavval lízisnek alávetett sejteket tartalmazó minta) átlagával ahhoz, hogy megkapjuk a százalékos kiválasztást. A kontrollminták tartalmaznak antigént, azonban nem tartalmaznak kísérleti vegyületet. A vakminták (vagy spontán kiválasztású minták) nem tartalmaznak sem antigént, sem kísérleti vegyületet. A vakminták (háromszoros ismétlést alkalmazunk) átlagát levonjuk a kontrolloknál és a kísérleti vegyületeknél mért százalékos kiválasztásból. A kontrolloknál és a kísérleti vegyületek csoportjánál az átlagokat kiszámítjuk, majd egy adott kísérleti vegyületre az eredményt a következő képlet alapján számítjuk: kísérleti vegyülettel %-os .......................... hisztamin-kiválasztás ,nn Százalékos gátlás =---------------------------------------ItHJ kontrolinál %-os hisztaminkiválasztás A kísérleti vegyület különböző koncentrációinál kapott értékeket használjuk az EDS0 (vagyis a hisztamin-kiválasztás 50%-os gátlásához szükséges, pM egységekben kifejezett koncentráció) megállapítására a lineáris regresszió módszerével. Az ebben a kísérletben néhány tipikus (I) általános képletű vegyülettel kapott eredményt az (I) táblázatban adjuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
