190919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusok szaporitására alkalmas sejttenyészetek előállítására
7 190.919 8 saratás a 7. napon történt, amikor a CP hatás a tenyészet minden sejtjére kiterjedt. A vírus titerét csirkeembrióbőr (CEB) szövettenyészetben történő bírálással ellenőriztük és titerét 104M- TCID5(/0,1 minek találtuk. Ugyanez a vírus csirkeembrióbőrből készült sejttenyészetben is hasonló titer elérése mellett szaporítható. A vírusnak a CEO sejttenyészetben való jelenlétét elektronmikroszkóppal is igazoltuk. 5. példa A tajálmány szerinti eljárással készült sejttenyészetet csírkeembríó chorioallantois membránján szaporított baromfihimlő galambtípusú vírustörzzsel is fertőztük. A tenyészetben a 5. napon jelentkezett CP hatás, amely a 6-7. napon vált erősebbé. A tenyészet sejtjei lekerekedtek és szabálytalan alakú folytonossági hiányok keletkeztek. A vírusaratás a 7. napon történt. A vírus titerét csírkeembríó chorioallantois membránján történő titrálással ellenőriztük és 1045 EIDJ(/0,2 ml-nek (egg infective doses 51% - tojásfertőző egység) találtuk. Ugyanez a vírus csirkeembrió chorioallantois membránján általában hasonló titerrel szaporítható. A vírusnak a sejttenyészetben való jelenlétét elektronmikroszkópos vizsgálattal is igazoltuk. 6. példa A találmány szerinti eljárással készült sejttenyészetet macskavese-sejttenyészeten izolált Canin Parvovírussal is fertőztük. Több egymás utáni passzázst is végeztünk a vírussal. A vírus a sejttenyészetben megtapadt, de csak alig látható, vagy csak részben észrevehető módon károsította a tenyészet sejtjeit. A vírusnak a sejttenyészetben való jelenlétét kísérleti állatfertőzéssel igazoltuk. A tenyészetben szaporított vírussal két fogékony, 8 hetes kutyát fertőztünk. Az állatok a fertőzést követő 3-4. napon már a parvovírusos bélgyulladás jellemző klinikai tüneteit mutatták, majd a 8-11. napon elhullottak. Boncolá- 5 suk alkalmával a parvovírusos bélgyulladásra jellemző kórképet találtunk. A vírusnak a sejttenyészetben való jelenlétét gradiens centrifugálással és elektronmikroszkópos vizsgálattal is igazoltuk. A találmány szerinti eljárással készült sejttenyészetben 10 szaporított vírussal inaktivált olajos vakcinákat készítettünk, melyek a gyakorlati körülmények között megfelelőnek bizonyultak. 7. példa 15 A találmány szerinti eljárással készült sejttenyészetben görényhez adaptált szopornyicavírust (Green-törzs) sorozatosan passzáltunk. A vírus a tenyészeten megtapadt, és az 5. passzázsban jól látható módon károsította a sejteket. A sejtlekerekedésben 20 és a szövettenyészet felszakadozásában megnyilvánuló citopatogén hatás a további passzázsokban következetesen megfigyelhető volt. A CP hatás általában a 6-7. napon volt a legkifejezettebb. A vírus 8. passzázsában a vírusnak a sejttenyészetben való je- 25 lenlétét a laktát-dehidrogenáz- (LDH) és a malát-dehidrogenáz (MDH) enzimek aktivitásának vizsgálatával is igazoltuk. A vírussal való fertőzés után naponként vett mintákban az LDH enzim aktivitása a 7-8. napon volt a legmagasabb. Az MDH enzim akti- 30 vitását csak a 8. napon vizsgáltuk. Az MDH enzim aktivitása a vírussal fertőzött tenyészetben magasabb volt, mint a vírussal nem fertőzött tenyészetben. Hat vírussal fertőzött és hat oltatlan kontrolltenyészet enzimaktiviTásait vizsgáltuk. A 3. táblázat az enzimakti- 35 vitásoknak 6-6 tenyészetben mért átlagértékeit mutatja. 3. táblázat Görényhez adaptált szopornyicavírus (Green-törzs) hatása CEO sejttenyészetek enzimaktivitásaira A tenyészetek LDH (/'mól NADH) ml/óra MDH (/'mól NADH) ml/óra kora Vírussal V írussal Vírussal Vírussal fertőzött nem fertőzőn fertőzött nem fertőzött Oóra 1,00 1,21 nem vizsg. nem vizsg. 3 nap 1,26 1,34 nem vizsg. nem vizsg. 4 nap 1,70 1,67 nem vizsg. nem vizsg. 5 nap 1,39 0,99 nem vizsg. nem vizsg. 6 nap 1,60 1,21 nem vizsg. nem vizsg. 7 nap 2,05 1,46 nem vizsg. nem vizsg. 8 nap 2,31 1,36 1,29 0,82 Szabadalmi igénypontok 55 1. Eljárás vírusok, elsősorban epitheliotróp vírusok szaporítására alkalmas sejttenyészetek előállítására, azzal jellemezve, hogy 10-15 napig kelt.etett, SPF csírkeembríó fejét a szemgolyók mögött átmetsszük, és az így levágott feji részeket felaprítjuk, 60 tripszinnel emésztjük, és az így nyert sejtszuszpenziót borjúsavót és triptózfoszfátot tartalmazó tápközegben növesztjük. 2. Az 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 12 napig keltetett csirkeembriót használunk fel. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tripszines emésztést 0,1%-os tripszinnel végezzük. Rajz nélkül 5
