190809. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 76-11 jelű antibiotikum előállítására
1 2 190 809 Az Sp. 76-11 röviden a következőkkel jellemezhető: (i) Morfológia: Az Sp. 76-11 általában nem képez légmicéliumot, de olykor, hosszú tenyésztési idő után megfigyelhető légmicélium. A szubsztrát-micélium hajlott, és a tenyésztés végső időszakában osztódik, ellipszis alakú spórák képződése mellett. A micélium Gram-pozitív és saválló. (ii) Növekedés különböző táptalajokon : Az Sp. 76-11 számos különböző agar táptalajon nem vagy alig növekszik, a zabliszt agar és az élesztőkivonat-malátakivonat agar kivételével. A törzs legjobban zabliszt agar táptalajon nő és 3-4 heti tenyésztés után a sejtekben indigókék, vízoldható pigment képződik. (iii) Fiziológiai tulajdonságok: A törzs 33-37 °C-on jó növekedést mutat, a zselatint enyhén elfolyósítja, a lefölözött tejet koagulálja és peptonizálja és nem képez melamin pigmentet. (iv) Cukor-hasznosítás : A törzs jól hasznosítja az L-arabinózt, D-xilózt, D-glükózt, D-fruktózt, szacharózt, 1-inozitot, L- ramnózt, raffinózt és mannitot olyan Pridham— Gottlieb agar táptalajon, amelyhez 0,1% élesztőkivonatot adagoltunk. Mint fent leírtuk, az Sp. 76-11 az Actinomycetales rend Actinomadura genusához tartozó törzsnek látszik, a spórák és a micélium morfológiája, a különböző táptalajokon való növekedés és a sejtfal-összetétel alapján. Ha azonban, összehasonlítjuk az Sp. 76-11 jellemzőit a következő helyeken leírt, az Actinomadura genushoz tartozó törzsek tulajdonságaival : H. Nonomura, Y. 0}iara: Az Actinomyces-ek eloszlása a talajban. XI. Néhány új species az Actinomadura, genusban, Lechevalier et al., J. Ferment. Technoi. 49, 904-912, 1971; T. P. Preobrazhenskaya, M. A. Sveshnikova, L. P. Terekhova: Az Actinomadura genushoz tartozó speciesek azonosítási kulcsa. The Biology of the Actinomycètes and Related Organisms 12, 30-38, 1977; azt találjuk, hogy ezek nem ismertetnek olyan törzseket, amelyek zabliszt agar táptalajon indigókék sejt-pigmentet képeznek, amint ezt az Sp. 76-11 teszi. Ennek megfelelően azt a következtetést vontuk le, hogy az Sp. 76-11 új, az Actinomadura genushoz tartozó törzs. Az említett 76-11 antibiotikum előállítása során a 76-11 antibiotikumot termelő törzset az antibiotikum-termelésben alkalmazott hagyományos módszerek szerint tenyészthetünk. A tenyésztési mód nem különösebben kritikus, és folyékony vagy szilárd tenyésztést egyaránt alkalmazhatunk. A tenyésztés nagyüzemi méretekben és előnyös körülmények között való végzése érdekében ajánlatos olyan módszerek alkalmazása, amelyek szerint a táptalajt a 76-11 antibiotikumot termelő mikroorganizmus spóraszuszpenziójával vagy tenyészfolyadékával oltjuk be és a tenyésztést levegőztetés és keverés mellett végezzük. A találmány szerint alkalmazott tápanyag-forrás nem különösen kritikus; a mikroorganizmusok tenyésztésére szokásosan alkalmazott bármilyen tápanyag-forrás felhasználható. Szénforrásként keményítő, dextrin, glicerin, glükóz, szacharóz, galaktóz, inozit, mannit stb., nitrogénforrásként pedig 5 zabliszt, élesztő, pepton, szójaliszt, húskivonat, rizskorpa, búzakorpa, karbamid, kukoricalekvár, ammóniumsók, nitrátok és egyéb szerves vagy szervetlen nitrogén-vegyületek alkalmazhatók. Kívánt esetben más szervetlen sókat, így nátriumkloridot, 10 foszfátokat, kálium-, kálcium-, cink-, mangán-, vas-sókat adagolhatunk. Szükség esetén a táptalaj tartalmazhat állati-, növényi- vagy ásvány-olajokat is. A tenyésztési körülményeket - pl. a hőmérsékletét és az időt - a 76-11 antibiotikum maximális 5 termelése szempontjának megfelelően választhatjuk meg. A tenyésztést pH 4-9 értéken végezzük, előnyösen pH 7 körül, 25-35 °C-on, előnyösen 28-33 °C-on, kb. 5-20 napon - előnyösen kb. 5-11 napon - át. Magától értetődően azonban az olyan 0 tenyésztési körülmények, mint a táptalaj összetétele, a pH, hőmérséklet, kevertetés megfelelően változtatható, annak érdekében, hogy az alkalmazott törzs és a külső körülmények figyelembevételével optimális eredményt érjünk el. A tenyésztés befeje- 25 zése után a fermentlevet pl. centrifugáljuk, a sejteknek az oldatból való elkülönítésére. Az így előállított 76-11 antibiotikum a metabolitok elkülönítésére szokásosan alkalmazott bármilyen hagyományos módszerrel elkülöníthető a fermentléből. 30 Megemlíthető pl. az a módszer, amely a 76-11 antibiotikum és a szennyezések oldhatóságkülönbségét használja fel ; az a módszer, amely ezek abszorpciós affinitása különbözőségén alapul, vagy ezek kombinációja és szükséges esetben ismételt 35 alkalmazása. A 76-11 antibiotikumra jellemző, hogy mind a tenyészfolyadékban, mind a sejtekben jelen van és az oldhatóság-különbség alapján a tenyészfolyadékból etil- vagy butilacetáttal, kloroformmal, butanollal vagy hasonló oldószerekkel 40 extrahálható. A sejteket vizes acetonnal vagy vizes metanollal extraháljuk, a szerves oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk és az így kapott vizes oldatot etilacetáttal vagy hasonló oldószerrel extraháljuk. Az extrahált oldatokat egyesítjük és bepá- 45roljuk; így a 76-11 antibiotikumot tartalmazó nyers kivonatot kapunk. Mivel a nyers kivonat nagymennyiségű szennyezést tartalmaz, abszorpciós kromatográfiás kezelésnek vetjük alá szilikagél, alumíniumoxid stb. felhasználásával, majd tisztít- 50 juk. így pl. a nyers kivonatot kismennyiségű benzolban oldhatjuk és felvihetjük benzollal előzetesen egyensúlyba hozott szilikagél oszlopra. Ezt követően az eluálást benzollal, majd olyan benzol-etilacetát eleggyel végezzük, amelynek etilacetát tartalmát 55 fokozatosan növeljük. Az eluátumot frakciógyűjtővel frakcionáljuk. A biológiai aktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük és betöményítjük, egy tisztított por előállítására. A további tisztítás érdekében megismételjük a szilikagél-kromatográfiás eljá- 60 rást. Ezen túlmenően végezhetünk még újabb tisztítást, preparatív vékonyrétegkromatográfia segítségével, ha szükséges. Az ezt követő, csökkentett nyomáson való bepárlás tisztított terméket eredményez, amelyet kismennyiségű metanolban oldunk 65 és lehűtünk. A 76-11 antibiotikum színtelen kristá4
