190803. lajstromszámú szabadalom • Ráksejt elleni limfociták, valamint rákellenes hatóanyagok előállítására, amelyek az említett limfociátkat tartalmazzák
1 2 190 803 (pH 7,2), amely 0,85% nátrium-kloridot tartalmaz, adunk hozzá és a lemezt centrifugálásnak vetjük alá (600 ford/perc, 5 perc). A lemezt megfordítjuk és eltávolítjuk a nem reagált SRBÇN-t. A lemezhez festékoldatot adunk (bríllient cresyl blue, a Merck and Co. terméke), hogy a limfocitákat megfessük és rozetta alakú pozitivitásra megvizsgáljuk. Legalább 98% mutat rozetta alakú pozitivitást (T- sejtek). 2. Teszt példa Specifikus ráksejtpusztító aktivitás (a) Az 1. táblázatban bemutatott sejtek közül a következő 5 sejtcsoportot - melyek különböző GRA pozitivitást mutattak - alkalmaztuk a vizsgálat tárgyát képező emberi rákos sejtekként. Rákos célsejtek : (Burkitt limfoma) (Burkitt limfoma) (gyomorrák) (gyomorrák) (T-sejt leukémia) Falcon Corp. terméke) 1. számú BT-1 2. számú Daudi 3. számú KATO-III 4. számú MKN-45 5. számú MOLT Egy tárgylemezre (a Rákos célsejt GRA pozitivitás (%-a) tarfoltképződés GRAJ K”T Daudi (1. ábra) csoport ' 93,1 + + (2. ábra) KATO-III (3. ábra) 57,3 + (4. ábra) BT-1 (5. ábra) 50,1 + + (6. ábra) MKN-45 (7. ábra) 1,00 ± (8. ábra) MOLT (9. ábra) 0,6- (10. ábra) Ellenőrző BT-1 csoport 50,1- (11. ábra) 10 15 20 5 x 104 célsejtet rétegzünk centrifugálás segítségével (800 ford/perc, 5 perc). Ekkor üvegenként 4 x 103 1. példa szerinti eljárással nyert GRA-l-K-T-t adunk hozzá óvatosan és inkubáljuk egy órán át. A pusztító hatást a tarfoltképződés (plaque) alapján határoztuk meg és az alábbi módon jelöljük: + + szignifikáns pusztító hatás figyelhető meg + pusztító hatás figyelhető meg ± pusztító hatás kis mértékben figyelhető meg - pusztító hatás nem figyelhető meg. . A kontrollcsoportban nem érzékenyített, emberi perifériás vérből származó limfocitákat alkalmazunk, amelyeket az 1. példa szerinti eljárással állítunk elő, azzal a különbséggel, hogy GRA-t nem használtunk. Az eredményeket a 6. táblázat szemlélteti. Szembetűnő ebből (6. táblázat), hogy a találmány szerinti eljárással készített killer T sejtek erőteljes GRA specifikus citotoxikus hatással rendelkeznek. 6. táblázat (b) Ugyanazokat a rákos célsejteket, amelyeket az (a) szerinti vizsgálatnál alkalmazunk, (3,3 x 106) 8xl05 GRA-l-K-T-vel keverjük, (sejtarány: 5:1) és a kapott sejtkeveréket (a teljes szám 4x 10e) 15% FCS tartalmú RPMI-1640 tápközegen tenyésztjük. Egy óra elteltével a maradék sejtek számát meghatározzuk, és a citotoxikus hatás %-át az alábbi egyenlet alapján számoljuk ki : citotoxikus hatás %-a = a sejtek száma ,, a tenyésztés után w í/w — (1 —:---------; X IUUJ a sejtek szama tenyésztés előtt (4x 10e) Az eredményeket a 7. táblázatban szemléltetjük. 7. táblázat Sejtszám 25 30 35 40 45 Célsejt tenyésztés előtt tenyésztés után hatás %-a Daudi 4 x 10« 2,9 x 10« 28 KATO-III 4 x 10« 3,7 x 10« 7,5 BT-1 4 x 10« 3,2 x 10« 20 MKN-45 4 x 10« 3,9 x 10« 2,5 MOLT 4x 10« 4,2 x 10«-5 (c) A fenti (b) szerinti eljárást ismételjük azzal a különbséggel, hogy a GRA-l-K-1 és a célsejtek arányát megváltoztatjuk 5/3-ra. Az eredményeket a 8. táblázat szemlélteti. 8. táblázat Seitszám- a citotoxikus Célsejt tenyésztés tenyésztés hatás %-a előtt után Daudi 4x 10« 3,6 x 10« 91 KATO-III 4 x 10« 4,6 x 10« 24 BT-1 4 x 10« 1,4 x 10« 65 MKN-45 4x 10« 3,7 x 10« 7,2 MOLT 4 x 10« 4,1 x 10«-3 50 55 60 65 A fenti példában megfigyelhetjük, hogy a GRA-l-K-T erőteljesen kötődik a Daudi, a KATO-III és a BT-1 esetében, kevésbé aktív az MKN-45 és a MOLT esetében. 3. Teszt példa C3H/He spontán emlőrákos egereket bőr alá oltással kezelünk a 2. példa szerint előállított GRA-M-l-K-T-vel ‘3 x 10*70,3 ml/egér dózissal egy hétig minden második nap. Tíz nap után a gócot feltáljuk és megvizsgáljuk. Amint az a 12. ábrán látható, a limfociták a rákos sejtek közé beszűrődtek és a rákos szövet feltöredezése figyelhető meg. A 13. ábrán szintén megfigyelhető a rák meszesedése és ezt úgy tekinthetjük, hogy a találmány szerinti killer sejteknek valóban rákellenes hatásuk van. 1. összehasonlító példa Ebben a példában magukat a rákos sejteket, mint specifikus antigéneket alkalmazzuk a GRA helyett a találmány szerinti eljárásban. 9
