190751. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mixotfóf szövettenyészetek és herbicidrezisztens növények előállítására
4 190751 lajdonságaikban megfelelő növényekhez lehetne jutni. Célul tűztük ki olyan eljárás kidolgozását, amellyel a fotoszintézisgátló herbicidekre rezisztens növények szelekcióját normál laboratóriumi körülmények között, szövettenyésztéses módszerrel meg lehet oldani. Meglepő módon azt találtuk, hogy a szövettenyésztéshez szokásosan alkalmazott táptalajok cukorkoncentrációjának csökkentésével található egy olyan alacsony cukorkoncentráció, melyen a kalluszok növekedése még elfogadható mértékű, de ahol a növekedésért már számottevően a fotoszintézis felelős. Az igy kapott, anyagcseréjüket kis mértékben a külső cukorellátásra, de elsősorban a fotoszintézisre alapozó szövettenyészeteket mixotróf szövettenyészeteknek nevezzük, utalva az autotróf és a heterotróf rendszerek között elfoglalt közbenső helyükre. Ennek megfelelően találmányunk tárgya eljárás mixotróf szövettenyészetek előállítására magból, bármely növényi részből, protoplasztból vagy egyedi sejtből előállított fotoszintézisre képes vagy fotoszintézisre képes részeket tartalmazó szövettenyészetben, cukrot tartalmazó ismert táptalajon, megvilágítás mellett végzett tenyésztéssel, amelyet az jellemez, hogy a tenyésztést 1%-nál kevesebb cukrot tartalmazó táptalajon végezzük. A fenti meghatározásban és a leírás egészében - mint már említettük - mixotróf szövettenyészetek alatt olyan tenyészeteket értünk, amelyek növekedéséhez mind a táptalaj cukortartalma, mind a fény jelentős mértékben hozzájárul. A tenyészetek létrehozásakor az erre a célra szokásosan alkalmazott, tetszőleges növényi anyagokból indulhatunk ki. Megjegyezzük, hogy a lehetséges kiindulási anyagként megadott mag fogalma alatt a magból preparált embriót és a magból vagy embrióból kapott csíranövényeket értjük. Növényi részként levelet, szárat, gyökeret, virágot stb. vagy ezek részeit használhatjuk. A protoplasztok sejtfal nélküli növényi sejtek, amelyek az általunk használt értelmezésben magukba foglalják a fúzióval vagy egyéb sejtgenetikai módszerekkel megváltoztatott protoplasztokat is. Az egyedi sejtek (single cell) sejtfallal rendelkező növényi sejtek, beleértve a pollent is. Cukor alatt a növények számára hasznosítható cukrokat, előnyösen szacharózt és glükózt értünk [Plant Sei. Letters, 21, 209- -214 (1981)]. A találmány szerint a mixotróf szôvettenyészetek előállításához előnyösen steril levél- vagy szárdarabkákból ismert magaB cukortartalmú táptalajon készíteti szővettenyószetekből indulunk ki; tehát IX körüli cukrot tartalmazó táptalajon, 1000 lx körüli megvilágítás és 25 °C körüli hőmérséklet mellett kalluszképződést indukálunk. Pár holes tenyésztés után a kalluszokból kiveti inokulumokat alacsony (1% alatti) cukorkoncentrációjú táptalajra helyezzük, majd folytatjuk a növesztést, 1000 lx körüli megvilágítás mellett, 25 °C körüli hőmérsékleten. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganalosítá8i módja szerint a tenyésztést 0,2-0,8%, előnyösebben 0,2-0,5%, legelőnyösebben 0,2-0,3% cukrot tartalmazó, ismert táptalajon végezzük. A tenyésztéshez nincs szükség extrém körülményekre, az eljárás szokásos, steril laboratóriumi körülmények között, így 1000 lx körüli megvilágítás mellett, 25 ®C körüli hőmérsékleten végrehajtható, és egyaránt alkalmas autotróf növekedésre képes és képtelen szövetek tenyésztésére. Az így kapott mixotróf szöveltenyészetek alkalmasnak bizonyullak fotoszintézisgátló herbicidek elsődleges hatásának kimutatására, beleértve a fotodestrukció okozta kifehéredést is. Felhasználhatók a találmány szerinti 8zövettenyészetek fotoszintézisgátló herbicidek hatásának elkülönítésére más típusú herbicidek hatásától. így egyszerű, könnyen végrehajtható módszerrel megállapítható, hogy egy adott herbicid a fotoszintézis gátlásán keresztül fejti-e ki a hatását, és ha igen, van-e másodlagos hatása magasabb koncentrációban. Végül, a találmány szerinti eljárással előállított mixitróf szövettenyészetek alkalmasak a találmány alapcélkitűzésének megvalósítására: herbicidrezisztens növények szövettenyésztéses eljárással történő előállítására. Ennek megfelelően, a találmány további tárgya eljárás fotoszintézisgátló herbicidekre rezisztens növények előállítására szövettenyészetben végzett szelekcióval. Az eljárás lényege abban áll, hogy a találmány szerint előállított mixotróf szövettenyészetek alkalmaszintézisgátló herbiciddel kezeljük, a tenyészet zöldülésre képes részeit izoláljuk, majd ezekből ismert módon növényeket regenerálta tunk. A találmány szerinti eljárással előállított szövettenyészetek a legkülönfélébb típusú herbicidek, igy karbamid-származékok, triazin-származékok, uracil-származékok, difenil-éter, piridazin, hidroxi-benzonitril, nitrofenol, triadiazin-bipiridin, amid, anilid, triazol, tiokarbamát, illetve glicin típusú herbicidek vagy például klórszulfon hatásának tesztelésére, illetve ezekből a fotoBzintézisgátló hatásúnak bizonyult herbicidekre rezisztens növények előállítására is alkalmasak. A herbicid fotoszintézist befolyásoló hatását az jelzi, hogy a fényben, alacsony cukorkoncentréciójú táptalajon nevelt kalluszok ilyen herbicidek hatására kifehérednek. Kivételt képeznek a herbicid-rezisztenssé vált kalluszok, amelyek szelekciója legegyszerűbben éppen e tulajdonságuk alapján lehetséges. 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
