190747. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás reagenskészlet progeszteron kimutatására és meghatározására biológiai folyadékokból
t 2 190 747 A találmány tárgya javított eljárás és reagenskészlet progeszteron hormon kimutatására és meghatározására biológiai folyadékokból enzim-immun módszerrel, amely enzimmel kapcsolt haptént alkalmazó kompetitiv fehérjekötési módszer elvén alapul. A vizsgálandó biológiai folyadékok alacsony progeszteron koncentrációja miatt annak meghatározása csak az utóbbi két évtizedben, izotópok felhasználásán alapuló radioimmun módszer'segítségével vált lehetővé. (MURPHY, B.E.P.: J.Clin. Endocr., 1967.27.973., YALOW, R.S. — BERSON, S.A.: In: General Principles of Radioimmunoassay, USEAC Symposium, 1968.) Ezen módszer széles körő elterjedését korlátozza, hogy végrehajtása izotóp laboratóriumhoz és sugárzó anyagok felhasználásához kötött. Az eljárás hátrányainak (egyes izotópok rövid felezési ideje, a sugárzó hulladékanyagok tárolásának és megsemmisítésének szükségessége, a speciális sugárzó anyagok potenciális veszélyessége, a műszerezettségigény, stb.) kiküszöbölésére alternatív jelzési módszerek kifejlesztésére törekedtek. Az enzim-immun (EIA) eljárás lényege, hogy monospecifikus antitest korlátozott számú kötőhelyeiért verseng egymással a vizsgálandó mintában található jelzetlen és a reakciókeverékhez adagolt, enzimmel jelzett haptén. Az antiest által megkötött enzim-haptén konjugátum mennyisége — és így az antitesthez kötődött enzim aktivitása — fordítottan arányos a minta haptén-koncentrációjával. Az antitesthez kötött, illetve szabadon maradt haptén-enzim konjugátum elválasztása után az eredeti minta haptén-koncentrációja egyszerű (pl. spektrofotometriás) módszerrel, kalibrációs görbe segítségével meghatározható. Az első Ígéretes próbálkozkásokról VAN WEEMEN és SCHUURS (FEBS Lett., 1971.15.232.), valamint egyidejűleg ENGVALL ÉS PERLMANN (Immunochemistry, 1971.8.871.) számoltak be, felhasználva AVRAMEAS 1969-ben leírt enzim-antitest, illetve enzim-antigén konjugálási módszerét. SCHUURS és VAN WEEMEN 1971-ben 169116. ljsz. alatt Magyarországon is szabadalmaztatta módszerét, amely heterogén fázisú elválasztást alkalmazott a szabad és a kötött frakciók elkülönítésére. Ugyanők a 169436. ljsz. szabadalom szerint (1973) egymástól különböző kovalens kötéssel alakították ki az antiszérum termeléséhez használt immunogént és az enzimmel jelzett haptént. Az említett munkacsoport a szilárd fázishoz kötött második antitest (DASP) módszert alkalmazta a szabad ös a kötött hormonok elválasztására. Szabadalmuk magába foglalja a polisztirol hordozóhoz (pl. mikrotitráló lemez) kötött és így immobilizált első antitest felhasználását. Az említett szabadalom példaként szerepelteti a progeszteron meghatározását. NAKAO 1980-ban írta le (Acta Endocrinol. Copenhagen, 1980.93.223.) a progeszteron enzim-immun meghatározását, amelyben a jelző anyag E.coiiból nyert ß-D- galaktozidáz enzim, az elválasztáshoz kettős antitestmódszert használt. SAUER és munkatársai (SAUER, M.J. — FOULKES, J.A. - COOKSON, A.D. : Steroids, 1981.38.45.) cellulózhoz kötött antíprogeszteront, illetve mikrotitráló lemezhez kötött ellenanyagot használtak progeszteronmeghatározásukhoz, amelyet a 2090598. ljsz. brit szabadalom véd. ARNSTADT és CLEERE leírták (ARNSTADT, K.I.- CLEERE, W.F.: J. Repród. Fért., 1981.62.173.) a szilárd fázisú (cellulózhoz kötött) antitestet és peroxidázzal kapcsolt progeszteront alkalmazó anzim-immun eljárásukat. A cikk alapján elkészített, a leírttal azonos metodikát alkalmazó progeszteron-meghatározó reagens készletet a Biolab (NSZK) 1981. óta forgalmazza. Ennek az egyetlen kereskedelmi forgalomban kapható reagens-készletnek több hiányossága van: — mérési tartományán (0,03—3,0 pmol) belül a mérhető optikai denzitás-különbség maximálisan 0,3 — végrehajtása során háromszori centrifugálást és hűtött centrifugát igényel. A találmány szerinti eljárásnál a meghatározandó progeszteron tartalmú mintához 1:20 és 1:35 közötti mólarányú bovin szérum albuminból és progeszteronból kovalens kapcsolással készült antigénnel immunizált nyúl szérumát, mint antitestet és RZ = 1,2—1,8 minőségű peroxidáz enzimnek progeszteronnal előzőleg elkészített konjugátumát adjuk, majd a keveréket a vizsgálandó mintával legalább fél óra hosszat inkubáljuk és gyártási adagonként optimalizált mennyiségű anti-nyúl birkaszérum és 5—10% polietilénglikol keverékét adjuk hozzá, ezt követően a reakcióelegyet legalább 15 percig inkubáljuk, végül a kötött konjugátumot az oldattól elkülönítjük, és az enzimaktivitást önmagában ismert módon meghatározzuk. Az immunogén készítése során a szteroid egyik hidroxil csoportjával és a kapcsolóként használt borostyánkősav egyik karboxil csoportjával észtert képezünk, a másik karboxil csoportját pedig vegyes anhidrid módszerrel a carrier molekula (jelen esetben bovin szérum albumin, BSA) szabad amino csoportjaihoz kötjük. Az első antitest előállításához BSA és progeszteron 1:20 és 1:35 közötti molarányú konjugátumát használjuk immunogénként. Előnyösen a BSA-t és a 4-pregnen-lla-01-3,20-dion-lla-hemiszukcinátot 1:28 mólarányban használjuk az 1. példa b) pontja szerinti speciális immunizálási eljárással. Az enzim-haptén konjugálásához olyan eljárást dolgoztunk ki, amely nem igényel nagy tisztaságú peroxidáz enzimet, így az RZ = 1,2—1,8 minőségű tormaperoxidáz felhasználható. Az első antitest, a vizsgálandó minta és a peroxidáz enzimmel jelzett progeszteron keverékét legalább fél óráig, előnyösen 37 °C-on egy óráig inkubáljuk. Az immunreakció után a szabad és a kötött frakciót második antitesttel választjuk szét, amelynél a precipitációt 5—10%, előnyösen 9% polietilénglikollal, valamint a konjugátummal a reakciókeverékbe juttatott normál nyúlszérummal segítjük elő. Ezt követően a eakciókeveréket szobahőmérsékleten legalább 15 percig, előnyösen 20—40 percig inkubáljuk, végül a kötött konjugátumot az oldattól elkülönítve az enzimaktivitást önmagában ismert módon határozzuk meg. Az ismeretlen minták progeszteron koncentrációját a standard pontokból készített kalibrációs görbe segítségével számítjuk ki. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei: a) A találmány szerinti EIA eljárás jellegéből adódóan végrehajtható minden, a szokásos alapfelszereléssel ellátott rutin laboratóriumban b) A találmány szerinti eljárás felhasználható az orvosi és állatorvosi diagnosztikában a luteális működés ellenőrzésére, ezáltal a normális és patológiás ciklus diagnosztizálására, a korai vemhesség megállapítására, vagy kizárására, a termékenyítés optimális időpontjának ellen-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
