190687. lajstromszámú szabadalom • Eljárás poliszacharid alapú új antitrombotikus, valamint ezt hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
190687 5} vérzés-aktivitás, amely egy tág dózis-tartomány ban (30 mg/kg i.v.-ig) alig nő, ugyanakkor a heparin vérzés-akti-vitása 1 mg/kg i.v. dózisban tisztán észlelhető, és nagyobb dózisokban gyorsan nő: 6) „hasznosság/kockázat” arány, ami 10- -40-szer kedvezőbb, mint a heparin USP esetén [az antitrombotikus és haemorrhagiás aktivitás arányát értve ezen); és 7) félérték-idó, amely bizonyosan kétszer olyan hosszú, mint a heparin USP félórték-ideje. Ennek az érdekes hatásprofilnak tulajdonítható, hogy az új termék rendkívül alkalmas vénás trombózis és trombo-embolizmus kezelésére, illetve megelőzésére. A termék különösen alkalmasnak tűnik mindenekelőtt DVT (a mély vénák trombózisos megbetegedése) megelőzésére olyan betegek esetén, akiken csípő-műtétet hajtanak vagy hajtottak végre. Mindezideig a csípő-műtéteknél gyakran fellépő DVT és tüdőembólia megelőzésére nem álltak rendelkezésre megfelelő eszközök. A heparin alacsony dózisban (s.c.) nem hatékony, magasabb (i.v.) dózisok pedig ellenjavalltak a vérzés nagy kockázata miatt. Az új termék még magasabb dózisokban (egészen 400 mg/kg/nap dózisig) sem mutat mutagén vagy toxikus sajátságokat. Az új termék többféle módon előállítható. Emlősök zsigerszövete, így például tüdő, hasnyálmirigy, máj, belek és különösen bélnyálka szolgálhat alapanyagként. Az emlős szövetből a terméket kezdetben fehérjebontó enzimek (pl. sertés hasnyálmirigyéből kivont enzim, vagy bakteriális enzimek, mint például a Bacillus suhtilia-től származó proteázok) segítségével szabadítjuk fel. Az izolálás módja az, hogy a terméket bázikus ioncserélőn megkötjük, majd ezután vizes sóoldattal eluáljuk. A termék szerves oldószeres frakcionált kicsapással tovább tisztítható. Alaposabb vizsgálatok azt mutatták, hogy ha az ilyen módon kapott terméket chondroitináz ABC enzimmel kezeljük, a jelenlévő nagy-molekulájú galaktóz-amin-tartalmú poliszacharidok legnagyobb része eltávolítható. A visszamaradó termék (a kezdeti termék kb. 70-75%-a) azonban csaknem ugyanazt a meglepői farmakológiái hatásprofilt mutatja, mint a kezeletlen termék, vagyis az említett enzimatikus kezelés eredményeként a túlnyomóan nagy-molekula jií inaktív frakció (25-30 s ù 1 y % ) eltávolítható. A chondroitináz ABC enzimmel történő kezelés után kapott termék fizikai tulajdonságai az új heparinoid fentebb részletezett jellemzőin belül maradnak, kivéve, hogy a mólsúly-eloszlásban a nagy-molekulájú frakcióra jellemző csúcs és/vagy váll csaknem eltűnt, a jellegzetes rotáció felfelé tolódott, +45° és +75° között van, a gálák tóz-amin-tartalom pedig gyakorlatilag nullára csőikként. A találmány szerinti eljárás természetesen ennek a terméknek az előállítását is magában foglalja. Az i'ij termőik(ek) a heparin esetén hagyományosan alkalmazott módon alakítható! k ) gyógyászati dózis-formá vn, pőddául injeklálható készítmény előiállítása céljából vízben oldjuk, amelyhez, ha szükséges, további, gyógyászatilag alkalmas segédanyagokat (tartósító anyag, bizonyos sók) adunk. A klinikai alkalmazás subcután vagy intravénás (esetleg időszakos) injekció vagy infúzió segítségével történik. Egyéb adagolási módszerekre ugyancsak lehetőség van (pl. intrapulinonáris alkalmazás spray-belégzés útján vagy kúp formájában történő beadás). A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy oltalmi igényünket a példákra korlátoznánk: I. példa Marhatüdót (100 kg) sertés hasnyálmirigyéből származó proteolitikus enzimmel kezeltünk. 15 órai, 8,5-es pH-n, 40 ®C hőmérsékleten történő inkubálás uLán az elegyet kiszűrtük. A tiszta szűrletet erősen bázikus ioncserélővel (QAE Sephndex A50) hoztuk érintkezésbe, és 15 órán át kevertük. Ezután az ioncserélőt kiszűrtük, vizes nátrium-klorid olduttal (200 g/1) eluálluk. Az eluátumhoz 50 térfogat% koncentrációig metanolt adtunk. A keletkező csapadékot eltávolítotluk, ezután az anyalúghoz 75 térfogatai koncentrációig metanolt adtunk. A csapadékot kinyertük, 100%-os metanollal mostuk és megszorítottuk. A kapott fehér amorf por (22,7 g) galaktóz-amm-turtalma 0,45 mmól/g, glukőjz-atnm-lart.alma 0,54 mmól/g, áltagos molekulasúlya 6 600 dalton, másodlagos csúcs 38 000 dalion átlagnál (a meghatározás dexlránra vonatkoztatva történt), (cc)2j° = +34,2°, kén-tartalma 5,7%, nitrogén-tartalma 2,6%, ionos csoport-tartalma 3,90 meq/g, szulfamido-csoport-tarlalma 0,69 mmól/g, idóz/glükóz arány 2:1. A termék az 1. ábrán látható eleklroforézis-mintát mutatja (agaróz gél, 0,2 mólos kalcium-aceLálban egyensúly ban, pH - 7,2, puffer: 0,2 mólos kalcium-acetát, 300 V' max., 7 mA, 30 perc). IT. példa Sertés bélnyálkát (100 kg) 35 °C-on, pH = 8,2-nél 24 órán át Bacillus subUlis-lôl származó proteázza] kezeltünk. Az elegyet szűrtük, és n Liszta szűrletet az I. példában leírt móalon kezeltük. A kapott termék 3,2 g súlyú fehér, amorf por, galaktóz-amin-turlnlmn 0,38 mmól/g, giukóz-nmin-tnrlalmn 0,82 inrriól/g, átlagos molekulnsúlya 6 100 dalton, másodlagos csúcs 42 000 dalton átlagnál (dextránra vonatkoztatva határoztuk meg), {<)2q - +35,1°, kéntartalma 5,9%, nitrogén-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
