190680. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6"-O-karbamoil-tobramicin előállítására mikrobiológiai úton
6 190680 7 1. példa a.) Nebraraicin-5’-t tartalmazó fermentlé előállítása laboratóriumi fermentorban A Str. tenebrarius MNG 204 spóráival vagy vegetatív tenyészetével az alábbi öszazetételű, desztillált vízzel készült ferdeagarokat oltjuk: dextrin 1.0% élesztókivonat 0.1% kazein-hidroüzátum(10%-os)* 2.0% húskivonat 0.1% kobalt-diklorid-hexahidrát 0.001% agar 2.5% * enzimatikusan hidrolizált A táptalaj pH-ját sterilezés előtt vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, majd 121 °C hőmérsékleten 20 percen át sterilezzük. Négy napon át 37 °C hőmérsékleten ínkubáljuk a tenyészeteket, majd a táptalaj felületéről steril desztillált vízzel leválasztjuk a spórákat és az így kapott spóraszuszpenzióval 2x100 ml, 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban sterilezett alábbi összetételű, csapvízzel készült inokulum táptalajt oltunk: szójaliszt 2.0% kazein-hidrolizátum (10%-os)* 3.0% ammónium-nitrát 0.1% ammónium-klorid 0.3% kalcium-karbonát 0.3% magnózium-szulfát-heptahidrát 0.5% pálmaolaj és lenolaj 1:1 arányú elegye 3.0 glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 2.0% * enzimatikusan hidrolizált A táptalaj pH-ját vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, majd 121 °C hőmérsékleten 20 percen át autoklávban sterilezzük. A beoltott tenyészeteket 14-18 órán ét 2,4 cm átmérőjű kör mentén percenként 280- -at forduló síkrázógépen 37 °C hőmérsékleten tenyésztjük. 200 ml, így előállított, érett inokulummal 10 1 hasznos térfogatú laboratóriumi fermentorban 121 °C hőmérsékleten 45 percen át sterilezett, 5 1 térfogatú, csapvizzel készült alábbi összetételű főfermentációs táptalajt oltunk: szójaliszt 3.0% kazein-hidrolizátum (10%-os)* 5.0% ammónium-nitrát 0.1% ammónium-klorid 0.5% L-glutaminsav 0.8% kalcium-karbonát 0.5% magnézium-szulfát-heptahidrát 0.5% kobalt-dinitrát-hexahidrát 0.001% pálmaolaj és lenolaj 1:1 arányú elegye 3.0% glükóz (külön, 50%-ob oldatként sterilezve) 4.2% ’ enzimatikusan hidrolizált 5 A táptalaj pH-ját sterilezés előtt vizes ammónium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be. A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten végezzük. A fermentor keveröjének fordulat- 10 számát 360/perc-re állítjuk be. A táptalajon percenként 3 1 steril levegőt vezetünk ét. A tenyésztés 144. órájában a fermentlé 100 ml-enként 260 mg nebramicin-5'-t tartalmaz, 9 mg nebramicin-4 mellett. Nebramicin-2 15 nem mutatható ki. Főfermentációs táptalajként más összetételű táptalajokat is használhatunk. így például az a.) pont szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy főfermentációs táptalaj- 20 ként az alábbi összetételű táptalajt használjuk: szójaliszt 3.3% ammónium-klorid 0.6% " magnézium-szulfát-heptahidrát 0.7% 25 kalcium-karbonát 0.5% kobalt-dinitrát-hexahidrát 0.001% pálmaolaj 2.5% glükóz (50%-os oldatként külön sterilezve)* 2.1% 30 *A tenyésztéshez használt fermentor sejtanyagcserét befolyásoló geometriájától és szerelvényeitől függően a táptalaj glükóz-koncentrációját 4.0%-ig növelhetjük. A tenyésztés 144. órájában a fermentlé 35 100 milliliterenként 180 mg nebramicin-5’-t tartalmaz kevéB (legfeljebb 3 mg) nebramicin-4 mellett. Nebramicin-2 nem mutatható ki. 40 b.) Nebramicin-5’-t tartalmazó fermentlé előállítása 1000 literes üzemi fermentorban Nagymennyiségű nebramicin-5’-t tar- 45 talmazó fermentlé előállítására az a.) pontban megadottak szerint eljárva 100 ml inokulum táptalajt beoltunk a Streptomyces tenebrarius MNG 204 törzs spóráival vagy vegetatív tenyészetével és tenyésztjük a mikroorganizmust. 14-18 óra múlva 100 liter steril inokulum táptalajt oltunk a tenyészettel és 37 °C hőmérsékleten fermentálunk. A táptalajon percenként 100 liter levegőt vezetünk át és percenként 360-at forduló keverót mü- 55 ködtelünk. 16 óra múlva 50 liter inokulummal beoltunk 1000 liter, saválló acélból készült fermentorban sterilezett, az a.) pontban megadott összetételű főfermentációs táptalajt. A fermentáció közben pecenként 500 liter le- 60 vegőt vezetünk át a tenyészeten, és percenként 200-at forduló keverővei keverjük. A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten végezzük. A tenyészet antibiotikum-tartalmának változását a 2. táblázatban adjuk meg. 50 5
