190620. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inaktivált baromfipestis-vakcina előállítására
2 190620 3 A találmány tárgya eljárás baromfiak Newcastle betegségének megelőzésére alkalmas inaktivált vakcina előállítására. Az 1940-es évek elején Kaliforniában jelentkező Newcastle betegség (baromfipestis) járvány idején alkalmaztak először a betegség ellen inaktivált vakcinát, majd sokan próbálkoztak hatékony inaktivált oltóanyag kifejlesztésével (Lancaster, J. E.: Vet. Bull., 34, 57. (1964)). Az adjuváló szerek tökéletlensége, és a nem megfelelően megválasztott immunizálási programok miatt azonban ezek a vakcinák nem váltak be. Az 1950—70 közötti években az egész világon az élővírus-vakcinák teijedtek el, lentogen (avirulens) és mesogen (közepesen legyengített) törzseket alkalmaztak vakcinaként, kielégítő eredménnyel (Lancaster, J. E. id. h.). Az 1960-as évek végén jelentkezett világméretű járvány nyomán azonban az a vélemény alakult ki, hogy az addig alkalmazott immunizálási programok nem képesek a virulens baromfipestis teijedését meggátolni és a termelési veszteségeket kiküszöbölni. Ezért indult meg világszerte kutatómunka más immunizálási programok fejlesztésére. Ezek azt bizonyították, hogy a néhány hetes korban élő, lentogén (nagymértékben legyengített) kissé virulens vírussal vakcinázott állományok 16—20 hetes korbani olajos vakcinákkal való immunizálása egy tojószezonra megfelelő védelmet nyújt a baromfipestis-vírus kártételei ellen. Ezért hazai alapanyagokból inaktivált olajos baromfipestis vakcina előállítását céloztuk meg. A találmány célja, hogy egyszerű eljárást biztosítson a baromfipestis betegség ellen hatásos védettséget adó inaktivált vakcina előállítására. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a baromfipestis ellen megfelelő immunitást biztosító vakcinát állíthatunk elő, oly módon, hogy 9—12 napig, előnyösen 10 napig előkeltetett SPF tyúktojásokat megfelelő antigén hatással rendelkező törzzsel beoltunk. Az oltástól számított 2 és 4 nap között, előnyösen a 3. napon az embriókról az allantoamnion folyadékot leszívjuk, homogenizáljuk, pH-ját 5,8 és 7,8 közötti, előnyösen 7,2 értékre állítjuk be, majd formaldehiddel, etiléniminnel vagy béta-propiolaktonnal inaktiváljuk és valamely depó hatású, előnyösen ásványi olajjal vagy Al(OH)3 vagy A1P04 géllel hozzuk össze. Az inaktivált vakcinában az ,,NDV—6” jelű törzset használtuk. (Tulajdonságainak részletes leírása: a J. gén; Virology 1973, 21. 305—313 és Arch. g. Virusforsch. 1975. 47. 249—255 cikkben található. A vírustörzsek fizikokémiai és biológiai tulajdonságai alapján más NDV törzsektől megkülönböztethető) NDV— 6—(82)1 jelű változatát MNG 00254 számon helyeztük letétbe. Az NDV—6-os törzset azon az alapon választottuk ki, hogy olyan tulajdonságokat egyesít magában, amelyek nélkülözhetetlenek egy gazdaságos, biztonságos és hatékony vakcinához. Ezek a következők: 1. A vírustörzs hőstabilitása rendkívül nagy, a biztonság szempontjából szóbajöhető nem virulens törzsek közül a legnagyobb, ezért a termelés során spontán inaktiválódás miatt fellépő vírusaktivitás veszteség minimális. 2. A vírustörzs élő állapotban is avirulens, ezért esetleg tökéletlen inaktiválás során, ha nem tökéletesen in aktiválódott azaz élő részecskék maradnának vissza a vakcinában, az ilyen oltóanyag is teljesen veszélytelennek tekinthető. Mivel avirulens törzsről van szó, a vírustermelés azonos biztonsági feltételek betartását igényli, csak mint a LaSota törzsé, (lentogén, azaz avirulens törzs). 3. Számos más, köztük mesogén (közepesen legyengített) és velogén (teljes virulenciával rendelkező) törzsből készült és egységnyi vírust tartalmazó oltóanyag immunizáló képességét összevetve megállapítottuk, hogy inaktiválás után az NDV—6 volt a legjobb. A találmány szerinti eljárással az NDV—6 törzsből olyan inaktivált vakcina állítható elő, amely az eddig szokásosan alkalmazott élővírusos vakcinánál is magasabb ellenanyagválaszt indukál a szervezetben. A kapott vakcinát a bevezetőben részletezett kórképek megelőzésére, illetve az említett állatok inununizá-' lására használhatjuk fel. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. * 1. példa Az NDV—6 antigén vírus előállítására 10 napig előkelletett embrionált tyúktojásokat használunk. A tojások ;dlantoamnion üregébe 0,1 ml, 100—10 000 E1D5o/0,1 ml item NDV—6 vírusszuszpenziót juttatunk, melynek hatására az oltástól számított 72—96 óra között vírusban gazdag allantoamnion folyadékot nyerünk. A tojások tompa felén a légkamrák magasságában a tojáshéjat izzó drótkaikával körbeégetjük. A héj eltávolítása után az allantoamíion folyadékot a tojásokból összeszívjuk és egységesítek. Ezután meghatározzuk a vírustartalmú, egységesített rllantoamnion folyadék vírustiterét, haemagglutinációs és neuraminidáz aktivitását. A vírustartalmú alapanyagnak legalább 107 EIDjo/1 ml titerűnek kell lennie. Az NDV—6 vírusszuszpenziót 409 pg/ml nátriumaziddal konzerváljuk, majd 400 pg/ml formaldehiddel inaktiváljuk. Az inaktiválás 37 °C-on 24 óráig tart, majd az anyagot +4 —8 °C-on tároljuk tovább. Tojásoltással ellenőrizzük az inaktiválás eredményességét. A bakteriológiai fertőzöttséget a VI. Magyar Gyógyszerkönyv előírásai szerint vizsgáljuk. Az inaktivált és steril antigént azonos mennyiségben inkomplett olajadjuvánssal (Humán Oltóanyagtermelő Vállalat gyártmánya) keverjük össze és homogenizáljuk. A kapott vakcinát +4—8 °C tároljuk. Az oltóanyag lejárati ideje ilyen tárolás mellett 1 év. 2. példa Az 1. példában leírt módon előállított NDV—6 vírusszuszpenziót 500 pg/ml végkoncentrációban etiléniminnel inaktiváljuk. Az inaktiválást 37 °C-on 24 óra hosszat végezzük. Az ínaktíváit és steril antigént azonos mennyiségben inkomplett olajadjuvánssal keverjük össze és homogenizáljuk. Az első példa szerinti vakcinához hasonló eltarthatóságú és hatékonyságú vakcinát kapunk. 3. példa Az 1. példában leírt módon előállított vírusantigént 2000 íig/ml a végkoncentrációban béta-propiolaktonnal inaktiváljuk az 1. vagy 2. példában leírtak szerint. Az inaktívált antigén 100 ml-éhez 100 ml 2%-os 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
