190406. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-tejsav előállítására lactobacillus bulgaricus DSM 2129 alkalmazásával
1 190 406 2 savnak kalcium-karbonáttal történő semlegesítésénél felszabaduló széndioxiddal vagy a fermentációs közegnek nitrogéngázzal való felülrétegezésével. A tejsavas erjesztést a 30 CC és 50 °C közötti hőmérséklettartományban végezzük. Különösen kedvező a reakció szempontjából a 40 °C és 50 CC közé eső hőmérséklettartomány. A találmány szerinti eljárásnál kiváló D-tejsavas sóból ioncserélő alkalmazásával vagy - a kálciumlaktát esetében - kénsavval történő savanyítással lehel a D-tejsavat nyerni. A találmány szerinti eljárást az alább következő példák világítják meg. A százalékos adatokat tömegszázaléknak kell tekinteni. 1. példa A Lactobacillus bulgaricus DSM 2129 mikrbbatörzs tenyészetének előállítása Egy fermentált tejpróbában talált Lactobacillus bulgaricus törzset izoláltunk és az alábbi összetételű, „Medium 1" jelzésű közegben tenyésztettük tovább; (valamennyi összetétel-adat g/1 egységben): Kazeinpepton (tripszines emésztésű) 10 Húskivonat (Merck) 10 Élesztőkivonat 5 Glükóz 20 k2hpo4 2 Nátrium-acetát 5 MgS04x7H20 0,2 MnS04x H,0 0,05 Nemionos felületaktív anyag 1 ml/1 tápközeg Ezután a meghígítolt tenyészetet agarlemezre oltottuk rá; ez utóbbit ugyanannak a közegnek (Medium 1) 1,8% agar hozzáadásával történő gélesítése útján állítottuk elő. A beoltott agarlemezeket ezt követően anaerob körülmények között 45 °C-on termosztátban egy napig tároltuk. Összesen 30 db individuális baktériumtelepet vettünk ki ezután a tenyészetből, s mindegyiküket egy tenyésztőcsőben helyeztük el; ez a következő összetételű „Medium 4” jelzésű közeget tartalmazta: (az adatok g/l-ben vannak) Glükóz 50 Kálcium-karbonát 70 Élesztőkivonat 7 Kukoricalekvár (szárított, porított) 15 Nátrium-acetát 5 Nemionos felületaktív anyag 1 ml/1 tápközeg Az inkubálási idő 45 °C-on 24 óra volt. 24 óra elteltével a különböző tenyészkultúrák közti különbség, a képződött D-tejsav mennyisége alapján világosan felismerhető. A legnagyobb D-tejsav tartalmat felmutató lenyészcsőből újabb kenelet készítettünk, s azt lemezre vittük. Ezt az eljárást 8 hét leforgása alatt többször ismételtük; eközben a tápközeg cukortartalmát először 8%-ra, majd további 5 hét után 10%-ra emeltük. Ezt követően a törzset még további 12 hétig szelektáltuk, míg végül képessé vált rá, hogy 1 liter tápközegben levő 100 g glükózt 24 óra alatt 65%-ban átalakítsa, 55 g/1 D-tejsavat termelve. A glükóz teljes lebontása 36-40 óra alatt figyelhető meg. 2. példa Az l. példában leírt eljárás szerint nyert Lactobacillus bulgaricus törzset tenyészcsövekbe oltottuk; ezek mindegyike 15 ml ..Medium 1” közeget tartalmazott. A csöveket függőleges helyzetben egy 45 °C-os inkubátorba tettük, legalább 8, de legfeljebb 20 órán keresztül inkubáltuk, aztán pedig Erlenmeyer-lombikba oltottuk át a tartalmukat; ezek egyenként 250 ml „Medium 1” közeget tartalmaztak. A lombikokat ugyancsak 45 cC-on, 8-20 óra hosszat tartottuk. Az említett Erlenmeyer-lombikok közül 6 db azt a célt szolgálta, hogy tartalmukkal egy 30 literes fermentort oltsunk be; ebben a következő összetételű, „Medium 2”-nek nevezett tápoldat volt: (az adatok g/l-ben vannak feltüntetve): Glükóz 30 Kálcium-karbonát 15 Élesztőkivonat 7 Kazeinpepton 10 Kukoricalekvár (szárított) 20 Nátrium-acetát 5 Nemionos felületaktív anyag 1 mi i A fermentor keverölapátjál 100 ford perc-re, hőmérsékletét 45 'C-ra állítottuk be: 8-12 óra múlva tartalmát egy 270 liter tápoldatot tartalmazó másik fermentorba öntöttük. Ez utóbbi vagy az 1. példában megadott, „Medium 4” jelű közeget vagy az alábbi összetételű „Medium 3” tápoldatot tartalmazza. Glükóz 30 Kálcium-karbonát 70 Élesztökivonat 7 Szójaliszt 15 Nátrium-acetát 5 Nemionos felületaktív anyag 1 Valamennyi adat g/l-ben van megadva. A fejlődés megindulása után, azaz mintegy 6-8 óra múlva, glükózt adunk pótlólagosan a fermentorba. A beadagolt glükóz mennyisége az elhasznált glükóz mennyisége és a savképzés függvényében alakul. 40-50 órán belül annyi glükózt adagolunk be, amely az egész tápközeg súlyának mintegy a 10%-át teszi ki. A glükózból 110-115 g D-tejsav képződik a lenyészközeg 1 literére számítva (ez megfelel 159-166 g kálcium-laktátnak). A lejsav felszabadítását és elkülönítését ismeri módszerrel végezzük: a kálciumsóból kénsavval felszabadítjuk a tejsavat, a keletkező kálciumszulfát csapadékot kiszűrjük, az oldatot bepároljuk és - etil- vagy metil-észter formájában - a tejsavat desztillációval tisztítjuk. A „Medium 3" tápközeg alkalmazásának megvan az az előnye, hogy a végtermékben nincs kimutatható mennyiségű L-tejsav. A „Medium 4" közeg előnye viszont az, hogy a fermentáció végeztével határozottan jobban szűrhető, mint a „Medium 3", mert az abban lévő szójaliszt lebontása csak részlegesen következik be. A „Medium 4" felhasználásá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
