190360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makrolid antibiotikumok előállítására
1 .190360 2 A DH-DO-OMT előállítása Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy eljárás a DH-DO-OMT előállítására, a DH-DO-DMT enyhe savas hidrolízisével. Az enyhe savas hidrolízis körülményei a szakember számára ismertek. A hidrolízis végrehajtására kb. 4 vagy ennél alacsonyabb pH-jú megfelelő oldatok alkalmazhatók. Ezen eljárás keretében kb. 20 °C - kb. 100 °C nagyságrendű hőmérsékletek alkalmazhatók. A hidrolízis végrehajtásához szükséges reakcióidő a reakcióelegy pH-ja és az alkalmazott hőmérséklet függvényében változik. Magasabb pH érték mellett a reakciósebesség alacsonyabb, magasabb hőmérsékleteken magasabb. A reakciót úgy hajtjuk végre, hogy a DH-DO-DMT-t enyhén savas oldattal kezeljük kellően hosszú ideig ahhoz, hogy végrehajtsuk a mikarozil csoport eltávolítását, a DH-DO-OMT keletkezése mellett. Egy másik megoldás szerint, amely olykor előnyösebbnek bizonyulhat, a DH-DO-OMT-t úgy állítjuk elő, hogy a DH-DO-DMT-t a fermentlében kezeljük, amelyben képződött, a fent leírtaknak megfelelően enyhén savas körülményeket alkalmazva, kellően hosszú ideig ahhoz, hogy a DHDO-DMT-t DH-DO-OMT-vé alakítsuk át. Az így előállított DH-DO-OMT a fermentléből a következőkben leirt eljárások segítségével különíthető el. A DH-DO-DMT és a DH-DO-OMT előállítása Str. fradiae-vel A DH-DO-DMT-t és a DH-DO-OMT-t egy Str. Fradiae törzs, pl. a Str. fradiae ATCC 31 733 tenyésztésével állítjuk elő, amely ezeket a vegyületeket termeli süllyesztett fermentációs körülmények között megfelelő táptalajon. A tenyésztést addig folytatjuk, amíg jelentős antibiotikus aktivitás nem halmozódik fel. A Str. fradiae tenyésztéséhez bármilyen táptalajt alkalmazhatunk, nagyszámú táptalaj közül. A termelés gazdaságossága, az optimális kitermelés és a termék elkülönítésének egyszerűsége érdekében azonban előnyben részesítünk bizonyos táptalajokat. így pl. a nagyüzemi fermentációban a kitüntetett szénforrások közé tartoznak a szénhidrátok, mint a dextrin, glukóz, keményítő, kukoricaliszt és az olajok, pl. a szójaolaj. A kitüntetett nitrogén források közé tartozik a kukoricaliszt, szójaliszt, halliszt, aminosavak stb. A táptalajba bevihető szervetlen tápsók közé tartoznak a szokásos oldható sók, amelyek vas, kálium, nátrium, magnézium, kalcium, ammonium, klorid, karbonát, szulfát, nitrát stb. ionok leadására képesek. A táptalajban jelen kell lenniük a mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges eszszenciális nyomelemeknek. Ilyen nyomelemek általában szennyezésként fordulnak elő a táptalaj más komponenseiben, kellő mennyiségben ahhoz, hogy kielégítsék a mikroorganizmus növekedési szükségleteit. A nagyüzemi fermentációban szükségessé válhat kismennyiségű (0,2 ml/liter) habgátló, pl. polipropilénglikol hozzáadása (molekulasúly kb. 2000), ha a habzás problémákat okoz. Jelentős mennyiségű DH-DO-DMT vagy DH-DO-OMT előállítására előnyben részesítjük a fermentotokban végzett fermentációt. Kismennyiségű DH-DO-DMT vagy DH-DO-OMT előállítható rázott lombikos tenyészetben. Az antibiotikum-termelésben egy holtidő lép fel azzal összefüggésben, hogy a nagy fermentorokat a mikroorganizmus spórás alakjával oltjuk be. Ezért előnyben részesítjük vegetatív inokulum felhasználását. A vegetatív inokulumot úgy állítjuk elő, hogy kistérfogatú táptalajt a mikroorganizmus spórás alakjával vagy micéliumtöredékével oltunk be és ily módon egy friss, aktívan növekedő tenyészetet kapunk. A vegetatív inokulumot ezután átvisszük egy nagyobb fermentorba. A vegetatív inokulum előállításához ugyanazt a táptalajt alkalmazhatjuk, mint a nagyobb volumenű fermentációkhoz, de más táptalajokat ugyancsak használhatunk. A Str. fradiae ATCC 31 733 kb. 10 és kb. 40 *C közötti hőmérsékleteken tenyészthető. Optimális antibiotikum-termelés várható kb. 28 °C körüli hőmérsékleten. Mint ez az aerob süllyesztett tenyésztési eljárások esetében szokásos, steril levegőt buborékoltatunk át a tenyészközegen. A hatékony antibiotikum-termelés érdekében a fermentor-tenyészet levegővel való telítettsége kb. 30% vagy ennél magasabb kell, hogy legyen (28 °C-on és 1 atm. nyomáson). Az antibiotikum-termelés úgy követhető a fermentáció alatt, hogy a fermentléből vett mintákat megvizsgáljuk olyan mikroorganizmusokkal szemben, amelyekről ismert, hogy érzékenyek ezekre az antibiotikumokra. Egy hasznos teszt-mikroorganizmus a Staphylococcus aureus ATCC 9144. A biológiai meghatározást előnyösen automatizált turbidimetriás módszerrel végezhetjük. Az antibiotikum-termelés ezenkívül egyszerűen követhető nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával, UV detektálás mellett. A DH-DO-DMT vagy a DH-DO-OMT, amely a süllyesztett aerob fermentációs körülmények között keletkezett, ismert eljárásokkal nyerhető ki a fermentléből. A DH-DO-DMT vagy a DH-DOOMT előállítását úgy végezzük, hogy a fermentlevet először szűrjük. A szűrt fermentlevet ezután tovább tisztíthatjuk a kívánt antibiotikum kinyerésére. Ezzel a tisztítással kapcsolatban számos eljárást alkalmazhatunk. A szűrt fermentlé tisztítására előnyben részesített eljárás keretében a lé pH-ját kb. 9-re állítjuk be; a levet megfelelő oldószerrel, pl. etilacetáttal, amilacetáttal vagy metil-izobutilketonnal extraháljuk; a szerves fázist vizes savoldattal extraháljuk és az antibiotikumot a vizes kivonat meglúgosításával kicsapjuk. A további tisztítás extrakciót, kromatográfiás és/vagy kicsapásos eljárásokat foglalhat magában. Az új mikroorganizmust, amely DH-DO-DMT-t és DH-DO-OMT-t termel, egy olyan Str. fradiae törzs kémiai mutációjával állítottuk elő, amely tilozint termel. Az új mikroorgaznizmus csak minimális mennyiségű tilozint termel, de főbb komponensként közel azonos mennyiségben állít elő DH-DO-DMT-t és DH-DO-OMT-t. A DH-DO-DMT-t és DH-DO-OMT-t termelő mikroorganizmust ugyancsak Str. fradiae-nek osztályozzuk. Az új mikroorganizmus tenyészetét 1980. október 16-án letétbe helyeztük az ATCC-nél (Rockville, Maryland). így az az alap-törzsgyűjte-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
