190358. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enduracidi előállítására
1 190 358 2 A tenyésztés körülményei a 2. példában megadottakkal azonosak. Ismeretes, hogy a szülőtörzs által termelt enduracidin főleg a micéliumban halmozódik fel [The Journal of Antibiotics, 21, 126 (1968], Az enduracidin-kiválasztó és/vagy m-fluoro-DL- tirozin rezisztens mutáns esetében is a termelt enduracidin nagyobb részét a micélium tartalmazza, amelyet a fermentlé szűrésével vagy centrifugálásával nyerhetünk ki. Feltételezzük, hogy mivel az enduracidin szabad bázis formájában alig oldható vízben, a mutánsok micéliumából kiválasztott enduracidin együtt nyerhető ki a micéliummal vagy a fermentlé egyéb szilárd részeivel. Ezért az ezek által a mutánsok által termelt enduracidin az enduracidin kinyerésére a szülőtörzsnél alkalmazott különböző ismert módszerek bármelyikével kinyerhető [3 786 142. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; The Journal Antibiotics, 21, 138 (1968)]. Előnyös eljárások pl. az enduracidin kivonása a micéliumból vizes metanollal vagy acetonnal, majd savanyítás sósavval, adszorpció aktív szénnel, adszorpció szintetikus adszorbens gyantával, ioncsere gyantával; extrakció szerves oldószerrel, kisózás, sűrítés vagy liofilizálás. Amikor csak viszonylag kis tisztaságú enduracidin felhasználására van szükség, pl. állattakarmányhoz kiegészítő anyagként akarjuk felhasználni, elég a micéliumot szűréssel kinyerni, vízzel átmosni és szárítóberendezésben közvetlenül megszárítani. A jelen találmányt a továbbiakban példákkal világítjuk meg, de ezek a példák nem határolják be a találmányt. A fermentlében felgyülemlett enduracidint kvantitatíven biológiai értelmezéssel határozzuk meg. Az enduracidint a fermentléből 70%-os acetonnal vonjuk ki, sósavval megsavanyítjuk, és biológiai értékmérést végzünk Bacillus subtilis PCI 219 törzszsel. Standardként enduracidin monohidrokloridot alkalmazunk (Enduracidin A: Enduracidin B = 58 : 42). 1 1. Példa (1) Kémcsőben 8 ml sporulációs tápközégből kialakított ferde agart (1% oldható keményítő, 0,2% élesztőkivonat, 2,0% porított agar, pH 7,0) inokulálunk Streptomyces fungicidicus B-5477 (IFO 12 439; ATCC 21 013) törzzsel, majd ezt 10 napon át 28 °C-on inkubáljuk, így spórázásra késztetve a mikroorganizmust. Az így kialakult spórákat platinakaccsal összegyűjtjük, majd 5 ml steril vízben szuszpendáljuk. A szuszpenzióban 5,1 • 108 spóra található milliliterenként. A szuszpenziót 2 számú üvegszűrővel (40-50 mikron) leszűrjük. Az így leszűrt szuszpenzió 2,6 • 108 spórát tartalmaz milliliterenként. A szuszpenzió 4 ml-ét üveglemezre viszszük át (9 cm átmérőjű Petri-csésze) és ultraibolya sugárzásnak vetjük alá (10 W pasztőröző lámpa) 40 cm távolságról 10 percig a lemez rázása közben; eközben a spórák 99,8%-a elpusztul. Az így kezelt szuszpenziót steril vizzel úgy hígítjuk, hogy 30-50 spórát tartalmazzon 0,1 ml-ben. Az így hígított oldatból 0,1 ml-t szélesztünk egy 9 cm átmérőjű lemezre, amely 15 ml agar tápközeget tartalmaz (0,5% pepton, 0,5% húskivonat, 0,5% nátriumklorid, 2,0% porított agar, pH 7,2), a lemezt 28 °C-on négy napon át inkubáljuk. A lemezre, amelyen 30-50 telep képződik, 5 ml, 1 • 106 Bacillus subtilis PCI 219 spórát tartalmazó lágy bouillon táptalajt rétegezünk, amelyet azután 37°C-on 16 órán át inkubálunk. Az így kialakított mintegy 21 000 telepből kilenc képez maga körül gátlási zónákat (15-23 mm átmérővel) a növekvő Bacillus subtilis PCI 219 felületén. Ezt a kilenc telepet bouillon agar lemezen megtisztítjuk, majd a korábban említett ferde tenyészetre visszük át a spórák képzése érdekében. A ferde tenyészetről spóraszuszpenziót készítünk, amelyet bouillon agar lemezre rétegezünk, hogy mintegy 10-20 telep képződjék, majd a lemezt 28 °C-on 4 napon át inkubáljuk. Az így inkubált táptalajra a mintegy fentebb említett mennyiségű Bacillus subtilis PCI 219 spórát tartalmazó lágy bouillon agart rétegezünk, a lemezt 37 °C-on 16 órán át inkubáljuk, és a képződött kerek zónák átmérőjét, ahol a Bacillus subtilis PCI 219 növekedése gátolva volt, megmérjük. A kilenc törzsből három nem képez kerek zónákat, öt közülük pedig 15-20 mm átmérőjű zónákat képez. A fennmaradó egy törzs mutatja a legnagyobb kerek zónát (24 mm átmérő) a Bacillus subtilis PCI 219 növekedésének gátlásában. A fenti módszerrel nyert törzset neveztük el Streptomyces fungicidicus GAB—453-nak. 1. Példa (2) 0,1 ml-t az 1. Példa (1) részében leírtak szerint a Streptomyces fungicidicus B 5477 (IFO 12 439; ATCC 21 013) törzsből készített, 1,2 • 109 spóra/ml koncentrációjú spóraszuszpenzióból 15 ml, 125 mikrogramm/ml m-fluoro-DL-tirozinnal kiegészített minimál agart tartalmazó lemezre szélesztünk, majd a lemezt 28 °C-on hat napon át inkubáljuk. Lemezenként mintegy 200 telep képződik. Közülük a viszonylag nagy méretű telepeket (kb. 1,5-2,0 mm), amelyekből kb. 10 db található lemezenként, azonos összetételű minimál táptalajra szélesztjük. A szélesztett táptalajt 28 °C-on öt napon át inkubáljuk, majd a táptalajon kinőtt telepet izoláljuk. Az így nyert telepek m-fluoro-DL-tirozin rezisztensek. Az így izolált 125 törzset 28 °C-on nyolc napon át az 1. Táblázatban bemutatott B tápközegben inkubáljuk, majd a termelőképességet mutató törzset kiválasztjuk. A fenti módszerrel nyert törzset neveztük el Streptomyces fungicidicus Emt 36-3-nak. 1. Példa (3) Az 1. Példa (1) részében leírt módszerrel indukált Streptomyces fungicidicus GAB—453 törzsből 2,1 • 109 spóra/ml koncentrációjú spóraszuszpenziót készítünk az 1. Példa (1) részében ismertetett módszer szerint. 5 ml, 200 mikrogramm/ml N- metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidint tartalmazó 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
