190347. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükoz-izomeráz előállítására
1 190 347 LU járás glükóz-izomeráz előállítására A találmány Streptomyces törzsből történő glükó/-izomeráz előállítási eljárásra vonatkozik. Ismeretes, hogy a D-glükóz D-fruktózzá történő átalakulása a glükóz-izomeráz enzim által valósul meg, melynek felhasználása mind gyakoribb a nagyfejlettségű országok élelmiszer- és élvezeticikk iparában és a diétás táplálkozásban. Keményítőépítő enzimek (a-amiláz és glükóamiláz) komplexével kombinációban a glükóz-izomeráz lehetővé teszi glükóz-fruktóz szirupok előállítását keményítőből, közvetlen enzimatikus úton. Glükóz-izomeráz előállítási eljárás 1957 óta ismeretes, amikoris Marschall R. O. és Kooi E. R. (1957. Science, 125, 3249. sz., 648.) először mutatták be D-glükóz közvetlen átalakítási lehetőségét D-fruktózzá, a 491-es és 492-es számú Pseudomonas hydrophila baktériumtörzs sejtjeinek segítségével. A leggyakoribb Streptomyces-fajok, amely mikroorganizmusokat glükóz-izomeráz előállítására felhasználnak, elsősorban a Str.phaeochromogenes (Strandberg J. W., SmilyK. L. 1971. Appl. Microbiol., 21, 4, 588.) és (TsumuraM., Sato T. Ibid., 1129.), a Str.venezuelae (Gratscheva I. M., Mossitschev M. S., Gavristov A. W., Filippov S. A. , 1977, 542 763. sz. szovjet szerzői tanúsítvány, Bulletin „Oktritija i Isobretenija”, 2. szám.) és (Iizuka H., Ayukawa Y., Suekane M., Kanno M. 1971., 3 622 463-as számú amerikai szabadalom), a Str.griseus (Hsu T. Y., Shon S. C., 1964. Sheng Wu Hua Usuen Yn Sheng Wu Li Hsuen Pao, 4, 342.), a Str.wedmorensis (az 1 361 846-os számú angol szabadalom), a Str.albus (TakasakiY., 49 981-es számú japán szabadalom), a Str.flavovirens, Slr.achromogenes, Str.achinatus (TakasakiY. 1971., a 3 616 221-es számú amerikai szabadalom), a Str.olivocinereus (Heady R. E., Jacaway W. A., a 2 223 864-es számú nyugatnémet szabadalom), a (lizukaH., Ayukawa Y., Suekane M., Kanno M. 1971., a 3 622 463-as számú amerikai szabadalom) és (Kooi E. R., Smith R. J. 1972. Food Technoi., 26. 9, 57.) a Str.olivaceus (a 2 223 340-es számú nyugatnémet szabadalom) és (a 2 131 984-es számú francia szabadalom) és más fajták. A Streptomyces fajtáin kívül aktív termelők a Proaktinomycetek és az Aktinomycetek más fajtái is: Nocardia, Micromonospora (Honvath R. O., Cole G. W. 1973., 2 156 622-es számú francia szabadalom) és (Horwath R. O., Cole G. W., 1973., 2 247 922-es számú nyugatnémet szabadalom), Actinoplanes (Scallet B. L„ Shieh K., Ehrenth a I. 1974. Stärke, 26, 12, 405) és (Shieh K. K., Lee H. A., Donnelly B. J. 1974. a 3 834 988-as számú amerikai szabadalom), Thermoactinomyces, Thermopolyspora (Takasaki Y. 1975., az 50-17 560-as számú japán szabadalom), és ugyanúgy egyes baktériumtörzsek, melyek az alábbi fajtákhoz tartoznak: Aerobacter (Heady R. E., Jacaway W. A., a 2 223 864-es számú nyugatnémet szabadalom), Acetobacter (Lliyd N. E„ Lewis L. T., Logan R. M., Patel D. N. 1972., a 3 694 314-es számú amerikai szabadalom), Lactobacillus (KentC. A., Emery A. N. 1973. J. Appl. Chem. and Biotechnoi., 23, 689.), Bacillus (Skot G., Outtrup H. In „5th Int. Ferment. Symp., 4th Int. Spec. Symp., Yeasts, Berlin, Abstr. Pap. Berlin, 1976, 256.), Arthrobacter (Lee C. K., Lawrence E. N., Long M. E. 1972., a 3 645 848-as számú amerikai szabadalom), Flavobacterium (a 3 956 066-os számú amerikai szabadalom) stb. A glükóz-izomeráz előállítására vonatkozó ismert eljárások egy sor hátránnyal járnak, melyek főképpen azzal vannak kapcsolatban, hogy a törzstermelők magas glükóz-izomeráz aktivitást csak az enzim kedvező hőmérséklet- és pH-optimuma mellett adnak. Ha az izomerizációs folyamat hőmérséklete alacsonyabb 60-65 °C-nál, az a telep mikrobiológiai szennyeződésének veszélyéhez vezet. A hőmérsékletet 90 °C-ig emelve, csökkenti az enzim stabilitását, a szirup elszíneződését és viszkozitásának megváltozását idézi elő. Az ipari méretekben történő felhasználásra tekintettel a legkedvezőbb a 6,5-7,0 közötti pH-érték, mivel 7,0 fölötti pH-értéknél a glükóz D-pepszikóze képződése közben alkálikusan izomerizálódik és a szirup elszíneződik; kis pH-érték pedig (5,5 alatt) az enzim irreverzibilis denaturálódását idézi elő. A találmány feladata glükóz-izomeráz előállítási eljárás kidolgozása Streptomyces-törzsből nagy aktivitással, az enzim magas hőmérsékleti és kedvező pH-optimumánál. Az 1339-es spec, számú Streptomyces-törzset - a glükóz - izomeráz termelőjét bolgár talajból izoláltuk. Ezért a felfedezésért 874 Streptomyces-törzset vizsgáltunk át. A rostálást a Krassilnikow szerinti I. számú modifikált szintetikus tápközegben végeztük, ahol a szelekciót xilóz és xilán igénybevételével két szubsztrát szinten valósítottuk meg. Ezek között a viszonyok között 18 Streptomyces-törzset fedeztünk fel, melyek a glükóz-izomeráz enzim termelésének fejlesztésére hajlandóságot mutattak, ezek közül különösen az 1339-es számú Streptomyces-törzs mutatkozott perspektivikusan is ipari célú felhasználásra alkalmasnak. A törzset az Állami Gyógyszerellenőrző Intézet, Boul. VI. Saimov 26., 1979. szeptember 29-én 144-es számmal vette lajstromba, és az alábbi morfológiai és biokémiai jellemzőket mutatta ki: Nitrogénforrás-tartalmú, I-es számú tápközegben (G. F. Gause és munkatársai szerint) a telepek rendszerint oválisak, alaktalan szélűek, laposak, egy középen domború, kupolaszerű, enyhén ráncos felületű centrummal. A spóratömlők spirálisak, max. 1-3 gyürűcskével. A növekedés jó. A spórák hosszúkásak, élesen tagolt szélűek és egyenetlen felületűek, 0,4-0,9 mikrométer a hosszúságuk és 0,3-0,6 mikrométer a szélességük. A szélek jól meghatározott szögűek. Más esetekben a spóra közepe kissé mélyített. Közvetlen sejtmagosztódással (fragmentációval) képződnek. A telepek oválisak, alaktalan szélűek, laposak, domború, gömbboltozat alakú középponttal, könnyen ráncolódók, egyes esetekben sugarasan tagoltak. A lég- és szubsztrátmicéliumok színét az A. S. Bondarzew és a Tresner-Backus skála szerint határoztuk meg. A szén- és nitrogénforrástól függően a különböző tápközegeknél a légmicéliumok színe a világosszürkétől a sötétszürkéig változik (a4-a2). A nitrogénforrás-tartalmú, 1-es számú tápközegben 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ?
