190141. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavin-tipusú anyarozs-alkaloidok előállítására
9 190141 10 1150 pg/ml, agroklavin tartalma 55 /ug/ml. 2. példa Az MNG 00211 számon deponált Claviceps fusiformis variáns törzs liofilizált tenyészetét 2 ml fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 500 ml-es Erlenmeyer lombikban Bterilezett 100 ml E táptalajra oltjuk. Az inokulumot az 1. példában megadott körülmények közölt 7 napig tenyésztjük, majd 2-2 ml-ét 2x100 ml, 500 ml-es Erlenmeyer lombikban előkészített „G" táptalajra oltjuk. 3 napos, 24 °C-on végzett rázatás után az oltótenyészetekkel 10 literes üvegfermentorban levő 5 literes sterilezőit „G” táptalajt oltunk. A tenyésztést 24 °C-on, percenként 0,5 liter/liter levegő átáramoltatásával, 430 ford/perces keverés közben 12 napig folytatjuk. A habzás megakadályozására szükség esetén steril Slruktol SB 2020 jelű habgátlót (gyártó: Schill und Seilacher, Hamburg) adagolunk kb. 0,5 ml/1 mennyiségben. (A habgátló poliglikol-észterek és alkil-poliglikol-éterek nem ionos kombinációja.) A tenyészet száraz micélium tartalma 16 g/1, és alkaloidtartalma az 1. példában leirt módszerekkel meghatározva 1550 /ug/ml őssz-alkaloid, melyből 1435 jug/ml az elimoklavin, és 90 pg/ml az agroklavin. 3. példa Az MNG 00211 szómon deponált Claviceps fusiformis variáns törzs liofilizált tenyészetét 2 ml fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót „B” jelű, ferde agar táptalajra oltjuk. A tenyészetet sötét helyiségben 24 “C-on 14 napig inkubáljuk. A felületen kinőtt tenyészetet 5 ml fiziológiás sóoldatban homogenizáljuk és 2 ml-ét két db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban előkészített 100-100 ml „F" táptalajra oltjuk. A tenyészetet 24 °C-on 5 napig rázatjuk, majd 10 literes üvegfermentorban lévő, 5 liter sterilizett „C ’’ táptalajra oltjuk. Az oltótenyésztést 24 °C-on 0,5 liter/liter/perc levegő átáramoltatással és 430 ford/perc keveréssel 2 napig végezzük. Az így nyert tenyészetet 160 liter őssztérfogatú saválló-acél fermenlorban lévő, 110 liter sterilizett, 20 g/1 nátrium-kloridot tartalmazó „C” táptalajra oltjuk. A tenyésztést 0,4 liter/liter/perc levegő átáramoltatással, és percenként 220 fordulatszámú keverés közben 24 °C-on 12 napig folytatjuk. A habzás megakadályozására sterilizett Struktol SB 2020 jelű habgátlót adagolunk a tenyészethez, melynek mennyisége a teljes fermenláci- 5 ós idő alatt kb. 220 ml. A tenyésztés végére elért Bzáraz micéliumtartalom 15 g/1 és az össz-alkaloid tartalom 1815 pg/ml; ezen belül az elimoklavin szint 1630 pg/ml, az agroklavin szint pedig 240 pg/ml, mely értékekei 10 nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel a következőképpen határoztuk meg: A szűrt fermentléből egy részt desztillált vízzel 10-szeresre hígítunk, és ebből 20 jul-t injektálunk Labor MIM típusú nagy- 15 nyomású folyadékkromatográf 4,6x250 mm méretű, Nucleosil 10 C 18 adszorbenssel töltőit oszlopéra. Az elúciót 1,0 ml/perc áramlási sebességgel acetonitril és 0,01 M ammónium-karbonát 3:2 arányú elegyével végezzük. A 20 detektálás UV detektorral 280 nm-en történik. A k'roraalograramon az elimoklavin 8,7, az agroklavin 32,0 perces retenciós idővel jelenik meg. 25 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás az I általános képletű klavin-típusú anyarozsalkaloidok - ahol R metil-, vagy hidroxi-metil csoportot jelent - előállí-30 tására Claviceps fusiformis törzzsel szón- és nitrogénforrást, ásványi sókat, valamint adott esetben egyéb adalékanyagokat tartalmazó folyékony táptalajon, alámerülö kultúrában, aerob körülmények között végzett fer- 35 menláció útján, azzal jellemezve, hogy termelő törzsként MNG 00211-számon letétbe helyezett Claviceps fusiformis variáns törzset alkalmazunk. 2. Eljárás az MNG 00211 számon deponált 40 új Claviceps fusiformis variáns törzs előállítására és fenntartására, azzal jellemezve, hogy az MNG 00164 számon deponált Claviceps fusiformis kiindulási törzset szén- és nitrogénforrást, valamint ásványi sókat tar-45 talmazó agar-lartalmú szilárd táptalajon, és a táptalaj 1 literére számított 1-10 mmól menynyiségű barbiturát-tlpusú adalékanyag jelenlétében 20-28 ®C hőmérsékleten 7-21 napig inkubáljuk, ás a kapott, a kiindulási törzstől gQ ülés színük ás laposan elterülő alakjuk alapján jól megkülönböztethető telepeket szelektáljuk, és a szelekciói adott esetben barbiturát jelenlétében, vagy anélkül ismételjük, és a kapott új variáns törzset, mely legalább 55 85%-ban elimoklavit termel, elkülönítjük. 2 rajz, 3 ábra A kiadásért felel a Közgazdasági ás Jogi Könyvkiadó igazgatója 88.76.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató
