190129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karboxi-peptidáz b enzim elkülönítésére emlősők hasnyálmirigyéből
2 190129 3 A találmány tárgya új eljárás karboxipeptidáz B enzim elkülönítésére emlősök (elsősorban sertések) hasnyálmirigyéből. A kereskedelmi forgalomba kerülő karboxipeptidáz B enzimet sertés hasnyálmirigyéből izolálják, de a szakirodalomból ismeretesek eljárások más emlősök (pl. marha, kecske) hasnyálmirigy karboxipeptidáz B enzimjének elkülönítésére is. A J. Biol. Chem. 235, 2272 (1960) közlemény szerint a sertés hasnyálmirigyet felszeletelik, majd szobahőmérsékleten autolízisnek teszik ki. Ezután a hasnyálmirigy zsírtartalmát acetonnal, aceton-éter eleggyel és végül éterrel eltávolítják, a zsírmentesített szervet szárítják, porítják. Az acetonport vízzel extrahálják, az extraktumot ammónium-szulfáttal frakcionálják. Sómentesítés után a fehérje oldatot bekeveréseB DEAE-cellulóz ioncserének vetik alá. Elúció után a karboxipeptidáz B-t tartalmazó frakciót ammónium-szulfáttal frakcionálják tovább. Sómentesítés után újabb DEAE-cellulóz ioncsere következik, ezúttal oszlopkromatográfia formájában, majd ismét kicsapás ammónium-szulfáttal. A csapadékot dialízissel vagy gélszűréssel sómentesítik. Tárolás fagyasztott állapotban történik, mivel a liofilezés 25-45%-os inakválódést okoz. A termék fajlagos aktivitása hippuril-L-arginin szubsztráltal, 25 °C-on mérve 184,2 egység/mg, ami az autolizált szövetből készült extraktumhoz képest 16-17-szeres tisztulásnak felel meg. Jelenleg a fentiekben vázolt eljárást alkalmazzák a legszélesebb körben. A Biochemistry 1, 1069 (1962) közlemény szerint a marha hasnyálmirigy karboxipeptidáz B kristályos formában állítható elő, a tisztított zimogén, a prokarboxipoptidáz B aktiválásával. Ennél az eljárásnál a zimogén izolálásához ugyancsak a hasnyálmirigy acetonporának vizes extraktumát használják. A vizes extraktum tartalmazza a prokarboxipeptídáz B-t, amelyet kromatográfiásan tisztítanak először DEAE-cellulózon, majd DEAE-Sephadexen. A prokarboxipoptidáz B-t tripszinnel alakítják át aktív karboxipeptidáz B-vé, amelyet végül kristályosítanak. A Biochem. J. 163, 253 (1977) közlemény a karboxipeptidáz B enzimnek emberi hasnyálmirigyből való izolálását ismerteti. Az acetonpor készítés, az ammónium-szulfáttal történő kicsapás és a DEAE-celluíóz kromatográfia lényegében a J. Bioi. Chem. 235, 2272 (1960) közleményben leírtak szerint történik. Eltérés csak a DEAE-cellulóz kromatográfiánál alkalmazott puffer koncentrációban és az elúciós gradiensben van. Ezután a karboxipeptidáz B-t két frakcióra, Bi- és Bs-re választják szét Whatman CM-cellulóz 32 ioncserélőn végzett kromatográfiával. A Bi frakció fajlagos aktivitása 37 °C-on, hippuril-L-argininsav szubsztráttal mérve 1192 egység/mg, a Bj frakció aktivitása 862 egység/mg, ami 108-szoros, illetve 78-szoros tisztulásnak felel meg a vizes extraktumhoz viszonyítva. Kecske hasnyálmirigyből az Indian J. Biochem. Biophys. 12, 24 (1975), illetve 13, 106 (1976) közlemények alapján lehet karboxipeptidáz B-L izolálni. Az ismertetett eljárás lényege a következő: A kecske hasnyálmirigyet -20 °C-ori lefagyasztják, majd fagyasztott állapotban felszeletelik és a +4 °C-ra való visszaengedtetés során kicsorgó sejtnedvet összegyűjtik. Az összegyűjtött nedvet autolizálni hagyják. Ezután az oldat pH-ját 4,6-ra állítják, majd tízszeres térfogatra hígítják desztillált vízzel és +4 °C-on 2-3 óra hosszat állni hagyják a keletkező szuszpenziót. Az aktív karboxipeptidáz zöme ezalatt kicsapódik. A csapadékot báríum-hidroxiddal extrahálják pH=l 0,0-10,4-en, majd az extraktumból pHr6,5 értéken kristályosítják az enzimet, amelyet ezután még négyszer átkristályositanak. Az ily módon nyert készítmény további tisztítását az Indian J. Biochem. Biophys. 13, 106 (1976) közlemény írja le. Eszerint a pll=6,5- -nél kicsapódó anyagot 0,2 M Ba(0H)2-ben oldják, pH-ját ecetsavval pH=7,0-re állítják és ammónium-szulfétos frakcionálással, illetve ismételt ioricserével - DEAE-cellulózon - tisztítják tovább. A sómentesitett enzim-oldatot -20 °C-on tárolják. A termék specifikus aktivitása hippuril- L-arginin szubsztráttal mérve 102,66 egység/mg volt, ami 44-szeres tisztulásnak felel meg. A J. Mól. Catal. 10, 253 (1981) közleményben leírtak szerint a kecske hasnyálmirigy acelonporának vizes extraktumát aminónium-szulfáttal frakcionálják, majd a 0,3-0,8 telítésnél kapott frakciót CM-Sephadex C-50 és DEAE-cellulóz kromatográfiának vetik alá. Az így előállított termék specifikus aktivitása - hippuril-L-arginin szubsztráttal mérve -82,9 egység/mg volt, ami 18,2-szeres tisztulásnak felel meg. Mindezen eljárásoknak az a közös hátránya, hogy vagy a hasnyálmirigy sejtnedvböl, vagy a szerv ac.elonporából indulnak ki. A sejtnedv összegyűjtése nehézkes és sertés hasnyálmirigy esetében - a szerv magas zsír- és nyálkalartalma miatt - gyakorlatilag megoldhatatlan. Az acctonpor készítés drága, tűz- és robbanásveszélyes oldószereket (éter, acélon) igényel, továbbá a helyi melegedés következtében károsíthatja az enzimei, csökkentve a kitermelést és a specifikus aktivitást. További hátrány, hogy a megfelelően tiszta termék csak bonyolult, nagyszámú lépésből álló műveletsorral állítható elő. A találmány értelmében az ismert módszerek hátrányait kiküszöbölve, olyan eljárást kívánunk biztosítani a karboxipeptidáz B elkülönítésére, amely a sejtnedv gyűjtését, illetve az acctonpor készítést kiküszöbölve, egyszerűen végrehajtható műveleti lépések5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
