190077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nigericin tartalmú fermentlevek feldolgozására
2 190077 3 Találmányunk tárgy javított eljárás fermentációs úton képződő nigericin kinyerésére, a ferraentléból kiszúrt micélium alkoholos extrakciójával, azt kővető sóképzéssel és kristályosítással. A nigericin régóta ismert antibiotikum, már 1951-ben feltalálták. [Antibiotics and Chemotherapy 1, 594 (1951)]. A szakirodalomban a később leirt polieterin A, [J. Antibiotics 21, 402 (1968)], X-464,- és K-178 jelű antibiotikumok, és az azalomycin M,- és helexin C néven leírt antibiotikumok [Biochemical and Biophysical Res, Commun. 33, 29 (1968)], mint azt a további vizsgálatok bizonyították, a nigericinnel azonosnak bizonyultak. A nigericin az állatgyógyászatban coccidiosis elleni szerként használatos (3 555 150 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Alkalmazása orálisan takarmányban adagolva, vagy poralakban történik. A mikrobiológiai úton termelt nigericint, a 3 794 732 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint a fermentlé szűrése után nyert micéliumból nyerték ki, oly módon, hogy a hatóanyagot me til- alkohollal extrahálták, az extraktumot betöményítették, majd a vizes sűrítményből a nigericint butil-acetáttal extrahálták. Az oldószeres fázist mosták vizes dikálium-hidrogén-foszfát oldattal, vízzel, és a maradék bepárlása után egy olajos terméket nyertek. Az olajos maradékot petroléterrel extrahálták, és az oldószer elpárologtatása után visszamaradt olajos anyagot két lépésben extrahálták, először metil-alkohol és petroléter elegyével, majd 90%-os metil-alkohollal. Az így nyert extraktumokat egyesítették, bepárolták. A maradékot benzolban oldották, és aktivált alumínium-oxiddal töltött oszlopon adszorbeáltatták. A szelektív leoldáshoz benzolt, benzol és dietil-éter elegyét, illetve dietil-éter és etil-alkohol elegyét alkalmazták. Más eljárás szerint [J. Antibiotics 21, 402 (1968), és 7 009 235 sz. japán szabadalmi leírás] a nigericint a metil-alkoholos extraktum bepárlása után nyert sűrítményből kloroformos fázisba vitték, majd többszöri metil-alkohol-viz-kloroformos extrakcióval tisztították. A fermentáció során képződött olajos melléktermékektől nagy anyagveszteséggel járó, bonyolult oszlopkromatográfiás eljárással szabadultak meg. Ezek az eljárások körülményesek és nagy anyagfelhasználással járnak, ipari méretben csak nehezen valósíthatók meg. A leírásokban a szerzők kitermelési adatokat nem adtak meg. A 165 926 és 166 408 sz. magyar szabadalmi leírásokban egy Streptomyces albus törzzsel végrehajtott fermentációt és a képződő nigericin egyszerű módszerrel történő kinyerését írták le. Találmányuk alapja az a felismerés, hogy ha a micéliumot lúgos metil-alkohollal extrahálják, betóményítik és a sűrítményt vízzel hígítják, a nigericin az oldatból kiválik. Az eljárás előnye egyszerűségében rejlik. Hátránya, hogy a vizes oldatból a nigericinnel együtt kiválnak a fermentáció során képződött olajos melléktermékek, s az igy kinyert nigericin-alkálisó gyógyászati célra közvetlenül nem alkalmas. Átkristályosítéssal és/vagy oszlopkromatográfiás úton tovább kell tisztítani, a megfelelő minőségű termék előállítása céljából. Munkánk célja olyan eljárás kidolgozása volt, amely az állatgyógyászati célra megfelelő minőségű nigericin előállítását az eddig alkalmazott eljárásoknál egyszerűbben iparilag megvalósítható formában gazdaságosabban valósítja meg. Találmányunk alapja az a felismerés, hogy a fermentléből a micéliumot szűréssel eltávolítva, és a nedves micéliumból a hatóanyagot alacsony szénatomszámú alkohollal kioldva, az oldatot 20-50% alkohol tartalomig bepárolva, a~í"homogén oldatban alkáli-fém-hidroxiddal sót képezve, majd az oldatot kívánt esetben melegen aktív szénnel derítve, (szlntelenítés és olajmegkötés céljából) a nyert alkoholos oldatból hűtéssel és kevés ionmentes viz adagolásával a nigericin alkálisó leválasztható, és a kiváló termék szűrés és mosás után gyógyászati célra megfelelő tisztaságú. Az olajos melléktermékek, amelyek az eddig ismert eljárásoknál a termék szenynyeződését eredményezik, szürhetóségét is minőségét rontják, eljárásunkat alkalmazva az alkoholos anyalúgban és a kívánt esetben alkalmazott derítő szénben maradnak. Az anyalúgból alkohol-mentesítés után kiváló olajos, erősen szennyezett nigericin ismert módon kristályosítással tisztítható. Felismerésünk szerint a hatóanyag extrakciója alacsony szénatomszámú alifás alkohollal vitelezhetö ki, előnyösen a micélium tömegére számított 2-5-szörös oldószer térfogat használatával. Kísérleteink alapján az extrakcióhoz legelőnyösebbnek az etil- és i-propil-alkohol alkalmazása bizonyult, 'az azeotróp elegy desztillációval történő térfogatcsökkenése hatására sem válnak ki az olajos termékek, mint a metanol alkalmazása esetében. Eljárásunk alkalmas különböző mennyiségű (1000-10 000 (ug/cm3) nigericint tartalmasó fermentlevek feldolgozására 60-70% kihozatallal. Az eljárás előnye az ismertetett módszerekkel szemben, hogy így egyszerű módon, egy lépésben állatgyógyászati célnak megfeleld tisztaságú nigericin-alkálisót tudunk kinyerni a fermentléből, és nincs szükség köl-séges oszlopkromatográfiás tisztítás alkalmazására. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákban mutatjuk be részletesen anélkül, hogy találmányunkat ezekre korlátoznánk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3