190017. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pirimicin elkülönítésére és tisztítására
190017 A találmány tárgya új eljárás gyógyászati célokra alkalmas primicin gazdaságos elkülönítésére és tisztítására az előállítására szolgáló fermentléből. A primicin értékes antibiotikum, fermentációs előállítását a Thermopolyspora galeriensis mikroorganizmussal a 153 593 számú magyar szabadalmi leírás ismerteti. A primicinnek fermentlevekből való elkülönítésére, valamint tisztítására számos eljárás ismeretes (146 332 és 151 197 számú magyar szabadalmi leírások). A primicin gazdaságos ipari elkülönítését és tisztítását tűzte ki célul a 179.148 lajstrom számú magyar szabadalmi leírás. A leírás szerint a primicint 18-arabinozil-2-(n-butil)-3,7,11,15,19,21,23,25,27,37-dekahidroxi4, 16,32,34,36-pentametiltetrakonta-l 6-3 2-dién -3 5 -0-lakton-40-guanidinként, illetve ásványi savakkal alkotott sóiként említik, a megadott szerkezet azonosságát valószínűsítő adatokat azonban nem ismertetnek, noha kromatográfiás vizsgálatokkal kimutatható, hogy a Thermopolyspora galeriensis mikroorganizmus termelte primicin több, nem-polién típusú makrolid-lakton elegy éből áll, és a konkrétan megnevezett vegyület legfeljebb az egyik összetevőnek tekinthető. A többi - nem tisztázott szerkezetű — komponens elválasztására a leírás még utalást sem tartalmaz. Az ismertetett eljárás egyik — szakaszos — változata szerint a micéliumot víztartalmú, 1—6 szénatomos alkoholok terner elegyével extrahálják, másik — folyamatos — változata szerint vízmentes, szerves savak, illetve szerves aminok és 1—6 szénatomos alkoholok biner keverékével extrahálják, és a spontán kivált, meghatározott szerkezetű vegyületnek vélt hatóanyagot elkülönítése után víztartalmú, 1—6 szénatomos alkoholok terner elegyében oldják, majd mindkét esetben a szennyezéseket ismert módon elkülönítik, és a meghatározott szerkezetű vegyületnek vélt hatóanyagot szulfátsó alakjában izolálják vagy bázissá vagy más sóvá alakítják. Az eljárás előnyeként — az ismert eljárásokhoz képest — elsősorban az oldószerszükséglet csökkenését említik. Megállapítottuk, hogy a primicin szabad bázis vagy ásványi savakkal alkotott sói alakjában az ismert eljárásokhoz képest lényegesen egyszerűbben, tisztább állapotban különíthető el a fermentáció során kapott micéliumból, ha az extrahálást trikl őre cetsavat tartalmazó, 1—4 szénatomps alkanollal, előnyösen metanollal végezzük, és a triklórecetsav és az alkohol, előnyösen metanol mennyisége független a micélium hatóanyagtartalmától. Az ismert eljárásoknál ugyanis a primicin rossz oldhatósága miatt a hatóanyag-tartalom növekedésével az oldószer mennyiségét is arányosan növelni kellett (0,4 g hatóanyagAiter oldószer). A találmány szerinti eljárással elsősorban a genetikai módszerekkel kifejlesztett Thermopolyspora galeriensis TG—102/78 (MNG—00181) törzs tenyésztésével kapott fermentlé dolgozható fel különösen jó eredménnyel. A 179.148 lajstrom számú magyar szabadalmi leírásból megismerhető — szerves savként hangyasav használatát bemutató — eljáráshoz képest a triklórecetsav a szennyeződések, így zsírok, fehérjék, pigmentek beóldódását erőteljesen gátolja, ezáltal lényegesen tisztább, 3 magas hatóanyag-tartalmú extraktlé kapható. Eljárásunkban az említett közzétett magyar szabadalmi leírás 1. példájában részletezett megoldástól eltérően nincs szükség az ólomtartalom nehéz eltávolítása miatt hátrányos ólomacetátos derítésre. A találmányunk szerint úgy járunk el, hogy a Thermopolyspora galeriensis mikroorganizmus — előnyösen az MNG — 00181 törzs — tenyésztésével kapott, például 5000—5500 mg/ml hatóanyagot tartalmazó fermentlevet körülbelül 3,0—3,5 pH-értékre állítjuk, majd a fermentlevet szűrjük, a szűrletet kiöntjük, mivel a hatóanyag vízben gyakorlatilag oldhatatlan, és a micélium tartalmazza. A nedves micéliumot adott esetben szárítjuk, például porlasztva szárítással. A nyers micéliumot 1—4 szénatomos alkanolban, előnyösen metanolban oldott triklórecetsawal extraháljuk célszerűen 35—45 °C-on keverés közben, majd vákuumban vagy nyomás alatt szűrjük. A szűrőn maradt micéliumot metanollal mossuk. A kapott extraktlé gyakorlatilag az összes hatóanyagot tartalmazza. Az extraktlevet keverés közben derítjük, majd szűrés után kénsavat adunk hozzá, és alkil-aminnal, előnyösen dietil-aminnal 4,5—5,0 pH-ra állítjuk. Az ionmentesített vízzel hígított oldatot rövid ideig visszafolyatás közben forralva a kivált csapadék feloldódik, majd lehűtjük, a kivált, nyers primicín-szulfátot szűrjük, és a szűrőmaradékot acetonban való szuszpendálás után ismét szűrjük; szárítás után prí mi cin-szulfátot kapunk, amely legalább 85—87% hatóanyagtartalmú. A nyers primicin-szulfátot szükséges esetben triklórecetsavat tartalmazó alkanolból, előnyösen metanolból átkristályosíthatjuk. A fermentlé megsavanyítását például oxálsawal vagy 60%-os kénsavval végezhetjük. Metanol helyett bármely más, 2—4 szénatomos alkanol is analóg módon használható. A primicin-szulfátból a primicin bázis felszabadítható illetve más sóvá alakítható, illetve bármelyik sóból a primicin bázis felszabadítható. A triklórecetsav mennyisége a metanolban 1—4%, előnyösen 1,5—3%, célszerűen 2% lehet. A fermentációs műveletet a Thermopolyspora galeriensis MNG—00181 törzs felhasználásával a következőkben részletesebben ismertetjük. A Thermopolyspora galeriensis MNG—00181 törzs felületi tenyészetéről beoltjuk a következő összetételű steril táptalajt: 2% tripkazin, 2,4% burgonyakeményítő, 1,2% kukoricalekvár, nátriumklorid, kalciumkarbonát és sterilezés előtt 0,5% pálmaolaj (100 ml táptalaj 500 ml-es lombikban). A tenyésztést 28 °C-on, 48 óra hosszat rázóasztalon végezzük; a kifejlődött tenyészettel beoltjuk a 6 liter térfogatú inokulum táptalajt tartalmazó üvegfermentort. A tenyésztést 37 °C-on levegőztetés (3 liter/perc) és keverés mellett (500/perc) 24 óra hosszat folytatjuk. A kifejlődött tenyészetből 600 ml-t az alábbi összetételű, üvegfermentorban levő 6 liter fermentációs táptalajra oltunk: 4% szójaliszt, 4% burgonyakeményítő, 0,3% sztearinsav, kalciumkarbonát, nátriumklorid, káliumdi-4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
