189998. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anti-T-limfocita-globulin előállítására
1 2 München) Komplemen tkötiési-reakció Közvetlen hemagglutinádó Immunelektroforézis Immundiffúzió Poliakrilamid-gél-elektroforézls (Haematológial Intézet, München) HPLC gélszúrés (Haematológiai Intézet, München) Proteinmeghatározás Imminszupresszív tulajdonságok (átültetett bőr túlélési ideje majmokon: TNO Primates Center, Rijswijk). ATG-Fresenlus ® (Anti-human-T-limfocita-globulin) Vizsgálati módszerek 1. A közbenső termékek vizsgálata (az eljárás folyamán végzett vizsgálatok) 1.1 Egyedi házinyúlszérum-minták a) Sterilitási vizsdglat (baktériumok és gombák) a Ph. Eur. előírásai szerint, b) Hatás vizsgálata az antitest-titer meghatározása perifériás emberi limfocitákkal komplement-kötési reakcióban). c) Toxicitásí vizsgálat emberi eritrocitákkal (a hemagglutináló antitestek meghatározása közvetlen hemagglutinációs teszttel). A nem steril szérumokat kiöntjük. A komplementkötési reakció alsó határértéke » 1 .-64. Az ennél kisebb értéket mutató szérumokat kiőntjük. A komplementkötési reakcióhoz a felső határértéket nem kell megállapítani, minthogy a JM-sejtvonallal történő immunizálás nem eredményez 1.4000 feletti hemagglutinációs értéket. 1.2 Házinyulaktó származó szérumkombinációk A vizsgálatokat lásd: 1.1 a) - 1.1 c). A komplementkötési reakció alsó határértéke = « 1:256. 1.3 Abszorbensek a) Placenta (köldökzsinórból származó vér): Májgyulladást okozó vírusok (HbsAG-RIA) vizsgálata. Pettenkofer-hitézet, München. b) Placenta (pépesített és mosott): Sterilitási vizsgálat a Ph. Eur. előírásai szerint. A vírusokkal fertőzött, illetve a nem steril placentákat eldobjuk. c) A mosott eritrocita-koncentrátum sterilitás és a májgyulladást okozó vírusok vizsgálatát a vérbank végzi. 1.4 Kicsapott szérum Az ammónium-szulfáttal végzett kicsapás és az ezt követő dialízis után : a) Sterilizátis vizsgálat a Ph: Eur. előírásai szerint. b) Az lmmónium-szulfáttal dialízissel végzett eltávolítását úgy ellenőrizzük, hogy egy mintához salétromsavat és bárium-kloridot adunk. 1.5 A cellulóz ellenőrzése Ez az oszlopfrakcionálás előtt és után végezzük oly módon, hogy az eluátum pirogenitását vizsgáljuk (Limulus-teszt - Pyrogenitás). 1.6 Letöltés előtti végtermék-ellenőrzés a) Sterilitási vizsgálat (baktériumok és gombák). b) Pirogenitás vizsgálata in vitro (Limulus). c) Komplementkötési reakció perifériás limfovitäkkal. d) Fotometriás proteinmeghatározás 280 nm hullámhosszon. 2. A végtermék vizsgálata (Végső ellenőrzés) 2.1 A beadásra alkalmas termék általános jellemzőinek vizsgálata a) Szín: színtelen, víztisztától gyengén opalizáldlgb) Szag: speciális szag nem észlelhető. c) A szuszpendált anyag vizuális vizsgálata. d) A pH-értéke = 6,8-7,1. 2.2 Azonossági vizsgálat és a hatóanyag-tartalom mégha tározása a) Immunelektroforézis házinyulak teljes szérumával, valamint házinyúl-immunglobulinokkal. b) Pliakrilamid-gél-elektroforézis. c) HPLC-gélszűrés. d) Proteinmeghatározás (fotometria, 280 nm, kvóciens: 1,4). Az átengedés tűrési határa: ± 10% protein. 2.3 A hatás vizsgálata a) Komplementkötési reakció. b) Antitest-titer n)eghatározása emberi perifériás limfocitákkal. c) Limfocita toxicitásí vizsgálat Az 50%-os citotoxicitás alsó határértéke = 1:2000. d) Közvetlen hemagglutinádó Emberi eritrodtákat hemagglutináló antitestek meghatározása. 2.4 A végtermék tisztaságának vizsgálata a) Baktériumok és gombák vizsgálata a Ph. Eur. II előírásai szerint. b) Pirogenitásí vizsgálat a Ph. Eur. (1975) előírásai szerint. c) Vírusok vizsgálata (Pettenkofer-lnstitut). d) Idegen proteinek vizsgálata (Ouchterlony), e) Antitestek vizsgálata emberi szérummal (immunelektroforézis). f) Antitestek vizsgálata emberi trombocitákkal (trombocitaaggregáció). Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás anti-T-limfocita-globulin előállítására immunizált állatok, előnyösen názinyúl szérumából, azzal jellemezve, hogy az anti-T-limfocita globulínt JM-sejtsorral immunizált állatok szérumából állítjuk elő. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás anti-T-limfocita-globulin előállítására immunizált állatok, előnyösen házinyúl szérumából, azzal jellemezve, hogy az anti-T-limfocita-globulint a JM-sejtvonalnak a Pasteur Intézetben 1-147 szám alatt deponált törzsével immunizált szérumából állítjuk elő. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anti-T-limfodta-globulint immunizált házinyulak szérumából állítjuk elő. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás anti-T-limfocita-globulin előállítására, azzaljellemezve, hogy a JM-sejtsor lomfoblasztoid T-sejtjeinek tenyésztésével nyert termékkel antiszérumot készítünk in vivo és az anti-T-limfocitákat kinyerjük. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal 1 elle m e z v e , hogy a JM-sejtsor limfoblasztoia sejtjeit szuszpendált tenyészetben tenyésztjük, a kapott limfoblasztoid T-sejtekkel állatokat immunizálunk, az állatokat kivéreztetjük, a vért centrifugáljuk és az 189 998 6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
