189979. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makrolid antibiotikumok előállítására
189 979 ionokra, magnéziumionokra, kalciumionokra, ammóniumionokra, kloridionokra, karbonátionokra izulfátionokra, nitrátionokra és más, hasonló ionokra disszociáló sók. A mikroorganizmus növekedéséhez és kifejlődéséhez szükséges nyomelemeket szintén hozzáadhatjuk a táptalajhoz. Ezek a nyomelemek általában szennyezőanyagként jelen vannak a táptalaj többi összetevőjében, mégpedig a mikroorganizmus igényének megfeleld mennyiségben. Esetenként kevés (például literenként 0,2 ml) habzásgátló szert, például polipropilén-glikolt (molekulasúlya körülbelül 2000) adunk a nagytérfogatú fermentációk táptalajához, abban az esetben, ha a habzás problémákat okoz. Nagyobb mennyiségű DMOT vagy dihidro-DMOT előállításához tankfermentációval süllyesztett, levegőztetett körülmények között végzünk fermentációt. Kismennyiségű DMOT-t vagy dihidro-DMOT-t úgy állítunk elő, hogy rázott lombikban végzünk tenyésztést. Az antibiotikum termelésben mutatkozó lag-fázis miatt, amely általában akkor jelentkezik, ha nagymennyiségű táptalajt oltunk be a mikroorganizmus spóráival, előnyösen vegetatív inokulumot használunk. A vegetatív inokulum előállítására kismennyiségű táptalajt oltunk a mikroorganizmus spóráival, vagy micélium darabkáival, ilyenkor friss, aktívan növekvő tenyészetet kapunk. A vegetatív inokulummal ezután beoltjuk a nagymennyiségű táptalajt. A vegetatív inokulum előállítására használt táptalaj a főfermentációs táptalajjal azonos lehet, használhatunk azonban más összetételű táptalajt is. A S. fradiae NRRL 12171 mikroorganizmust 10°C és 27°C közötti hőmérsékleten növeszthetjük. Az antibiotikum termelés szempontjából optimális a 28°C. Ahogy az a levegőztetett, süllyesztett fermentációknál szokásos, a táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A nagymennyiségű antibiotikum termelés érdekében tankfermentációkor 28°C hőmérsékleten és 1 atmoszféra nyomáson 20%-os, vagy ennél magasabb levegő-telítettséget biztosítunk. A fermentáció során az antibiotikum termelést oly módon követjük, hogy mintákat az antibiotikumokra érzékeny mikroorganizmussal szemben ' mérünk. Mérőorganizmusként például Staphylococcus aureus ATCC 91144 mikroorganizmust használunk. A biológiai értékmérést előnyösen automatizált turhidometriás módszerrel végezzük. Az antibiotikum termelést ezen kívül követhetjük nagyfelbontású folyadék-kromatográflával UV-fényben. A süllyesztett, levegőztetett, fermentációs körülmények között kivitelezett tenyésztés után a DMOT-t vagy a dihidro-DMOT-t a fermentációs szakmában ismert módszerekkel különítjük el e tenyészléből. A DMOT vagy a dihidro-DMOT kinyerésére szűrjük a tenyészlevet. A szűrt lé tisztítása például oly módon történhet, hogy pHját 9-re állítjuk be, megfelelő oldószenei, például etil-acetáttal, amil-acetáttal, vagy metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, a szerves fázist elkülönítjük és vizes, savas oldatta] extraháljuk. Ezt követben kicsapjuk az antibiotikumot oly módon, hogy a vizes extrakt pHját lúgosra állítjuk be. A további tisztítási lépéseket extrakdóval, adszorpcióval és/vagy kicsapással végezzük. A találmány szerinti új mikroorganizmust a tilozint termelő Streptomyces fradiae kémiai mutagenezisével állítottuk elő. A mutagenizált mikroorganizmus csak kismennyiségű tilozint termel, termeli viszont a DMOT-t, mégpedig major komponensként. Jellemzés céljából az új mikroorganizmust összehasonlítottuk a Streptomyces fradiae M48-E 2724.1- törzssel, ez a törzs a S. fradiae NRRL 7202 mikroorganizmusból származik, és tilozint bioszintetizál. A S fradiae NRRL 2702 mikroorganizmust Hamill és munkatársai írják le a 3.178. 341. számú amerikai szabadalmi leírásban. A jelen leírásban a tilozint termeld S. fradiae M48-E 2727.1 tenyészetet E2724.1 törzsnek nevezzük. Az új DMOT-t és dihidro-DMOT-t termelő NRRL .12171 törzset szintén Streptomyces fradiae-nek határoztuk meg. A meghatározás során az International Streptomyces Project Streptomyces fajokra érvényes módszereit használtuk (Shirling és Gottlieb, Methods For Characterization of Streptomyces Species, Internal, Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3), 313-240 (1966), a vizsgálat során bizonyos kiegészítő vizsgálatokat is végeztünk. Az összehasonlítást az alábbi S. fradiae mikroorganizmusra vonatkozó irodalom figyelembevételével végeztük 1) Buchanan és Gibbons, Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás, The Williams és Wilkins Co7 Baltimore, Md., 1974. 815. oldal, és 2) Shirling és Gottlieb, Cooperative Dexcription of Streptomyces Ii. Species Description from First Study, Internal, Journal of Systematic Bacteriology, 18 (2), 118., 1968). Az új törzs és az E2724. 1 törzs spóraláncainak morfológiája: Retinaculum-Apertum (RA) csoportba tartozó. Horgok, hurkok, és szabálytalan gördültek láthatók, ezek rövidek, és általában keskeny átmérőjűek. Ezek legjobban az ISP 2 (élesztő kivonat-maláta-agar) táptalajon figyelhetők meg. A spórák felszíne sima, a spórák alakja ovális, átmérőjűekfO.óS pm. Átmérőjűk 0,61 pm és 0,71 -pm között változik. Altörzsek között a legnyilvánvalóbb különbség tenyésztési jellemzőikban mutatkozik. Az E2724.1 törzs a legtöbb táptalajon légmicéliumot fejleszt, a légmicéliumok jól fejlettek és a fehér színsorozathoz tartoznak. A DMOT-t termelő törzs egyáltalán nem, vagy csak kevéssé fejlett légmicéliumot fejleszt. Ha jelen van a légmicélium, úgy az a fehérszürke színsorozathoz hasonló. A telepek hátoldalán nem látszik színanyag-termelés. Színük világosközepesen sárga. A melanoid-pigment-termelés szempontjából a törzs negatív. (A melanoid-típusú színanyag termelését ISP ft 1 (tripton-élesztő kivonat), ISP ft 6 (pepton-élesztő ldvonat-vas-agar), ISP ft 7 (tirozin-agar) és ISP# 7 tirozin nélküli agaron vizsgáltuk). Az E2724.1 törzs és a DMOT-t termelő törzs közötti hasonlóságokat és különbözőségeket az I. táblázatban ismertetjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
