189706. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás interferon előállítására

1

189 706

2

szabb ideig tart, mißt egyébként.

Az „egyébként kifejezés olyan interferon előállítási eljárást takar, amelynek során az interferont limfoblasztoid sejtekkel a szakirodalomban ismert módon állítják elő, anélkül azonban, hogy az interferon képződési sebesség növekedésének időtartamát bármely módon befolyásolnák,

Az interferon képződési sebesség növékedési időintervallumának megnyúlása elérhető az interferon mRNS átíródási időszakának megnövelésével, azaz szuperindukció révén.

Ez az időtartam növekedés kényelmesen megvalósítható a jelen találmányban szereplő hozamnövelő szerek és körülmények alkalmazásával. A találmány így olyan módszerre is vonatkozik, amellyel az interferon termelés időszaka megnyújtható a hagyományos, ismert módszerekkel történő interferontermelés során tapasztalhatóhoz képest.

A jelen találmány igen előnyösen kombinálható ismert módszerekkel a limfoblasztoid sejtvonalakkal való interferon előállítás hozamának növelésére, így a hőmérséklet csökkentés és az indukció előtt a stimulátorral történő előkezelés egyaránt kombinálható az itt ismertetett módszerekkel és a kombináció révén jobb hozammal kapható az interferon, mint az egyes módszerekkel külön-külön. Különösen a sejtek indukció előtti, stimulátorral történő előkezelése (0 000 520 és 0 008 391 számú európai szabadalmi leírások, mindkettőre hivatkozunk is a jelen találmányban) bizonyultak előnyösnek.

Midőn valamely stimulátor hozamnövelő szerként is alkalmazható, ugyanazon vegyület két funkcióját is kihasználhatjuk. Előnyösen azonban az előkezelést a 0 000 520 számú európai szabadalmi leírás szerinti módszenei végezzük, vagyis alkánsawal vagy sójával, nevezetesen vajsavval vagy nátrium-butiráttal.

Ennek megfelelően a találmány tárgya még olyan interferon előállítására szolgáló eljárás is, amelynek során interferon termelésre serkenthető limfoblasztoid sejtekhez — amelyeket előzőleg megfelelő ám nem toxikus mennyiségű stimulátort tartalmazó közegben inkubáltak — induktort és az indukció során, vagy röviddel azután, az előzőkben ismertetett hozamnövelő szert adnak.

A találmány tárgya továbbá olyan, interferon előállítására szolgáló eljárás is, amelynek során interferon termelésére serkenthető limfoblasztoid sejtekhez — amelyeket előzőleg megfelelő, ám nem toxikus mennyiségű stimulátort tartalmazó közegben inkubáltak - induktort adunk és amelynél az Indukció utáni időszak, amikor az interferon képződés sebessége növekszik, jelentősen meghosszabbodik.

A következő példák a találmányt szemléltetik, anélkül azonban, hogy tárgykörét korlátoznák.

1. példa

Hozamnövelő szerek hatása az interferon termelésre

Kísérletsorozatot végeztünk, amelynek során Namalwa/WRL sejteket 5% felnőtt marha szérumot, polimixint, neomicint és a pH szabályozására nátrium-hidrogén-karbonátot tartalmazó PRMI 1640 táptalajon tenyésztettünk. Midőn a sejtkoncentráció 2x10® sejt/ml értéket ért el, mintát vettünk belőle, amelyet az említett táptalajjal duplájára hígítottunk. A sejtszuszpenzióhoz ezután 1 mM nátrium-butirátot adtunk, majd keverés közben 37°C-on 48 órán át inkubáltuk. Az inkubációs periódus után 800 g-val történő centrifugálással a sejteket elválasztottuk, és 2% felnőtt marha szérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajjal 3x10® sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót készítettünk belőlük. A sejtszuszpenzióhoz az interferonképzés indukálására 10 HAU/ ml Sendai vírust adtunk, majd az indukált sejteket 10 ml-enként 25 cm3-es műanyag lombikokba szétmértük. Az egyes lombikokat az 1. Táblázatban szereplő módon különböző hozamnövelő szerekkel kezeltük. Két lombikot hagytunk meg adagolatlan kontrollnak. A sejteket 24 óra múltán centrifugálással (800 g, 5 perc) eltávolítottuk és az interferont tartalmazó tiszta felülúszót, pH 2-re savanyítottuk, 24 órán át 4°C-on tartottuk, majd meghatároztuk az interferon tartalmat. A standard kontrolihoz (adagolatlan) viszonyított interferon-titer növekedést mindegyik hozamnövelő szerre kiszámítottuk. Az eredmények az I. táblázatban szerepelnek:

Az indulált tenyészethez A hozam- A kontrolladott hozamnövelő szer növelő szer viszonyított

Acetamid

végkoncentrációja (mM) 20

relatív

hozamnövekedés

2

Acetanilid

2

2

N-acetil-6-hidroxi-hexil-anin

5

3

N-butil-acetamid

5

5

Butiramid

10

3

N,N-dietil-acetamid

10

4

1,3-dietil-karbamid

5

J

N J'J-dimetil-acetamid

5

2

N ,N -dimetil-hexán amid

3

2

1,3-dimetil-2-imidazolidin

2

3

Dimetil-szulfoxid

140

4

1,1-dimetil-karbamid

10

2

1,3-dimetil-karbamid

5

3

p-etoxi-acetanilid

2

2

N-etil-acetamid

10

3

N-etil-pirrolidinon

5

3

Etil-karbamid

20

3

Hexametilén-bisz-acetamid

5

7

p-hidroxi-acetanilid

5

3

N-metil-acetamid

10

2

N -metil-benzamid

4

3

N-metil-2-piperidon

5

3

N-metil-2-pirrolidinon

10

4

Metil-karbamid

50

2

2-piperidon

25

2

Propionamid

20

3

Propil-karbamid

10

3

Piridin-N-oxid

50

4

Tetrametil-tiokarbamid

5

4

T etram etil-karbamid

8,4

6

2. Példa

Hozamnövelő szerek hatása az interferon termelésre butirátos előkezeléssel illetve anélkül Az 1. Példa szerint eloíllított Namalwa/WRL sejtszuszpenzlót friss táptalajjal 1x10® sejt/ml koncentrációjúra hígítottuk. A tenyészetet két egyenlő részre osztottuk és az egyikhez 1 mM nátrium-butirátot adtunk. Mindkét tenyészetet 48 órán át keverés közben inkubáltuk, majd Sendai vírussal indukáltuk az 1. Példa szerinti módon. Az indukált

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

4