189692. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a vér hemoglobinjának hem és globin részre való szétválasztására
1 2 A jelen találmány vér hemoglobinjának hem és globin részre való szétválasztás eljárására vonatkozik a vértől elkülönített vérsejteknek savas oldatban való felszuszpendálása — amikor is a hemoglobin hemre és globinra hidrolizálódik - és a hem lecsapása, valamint a csapadéknak a globin vizes oldatától való elválasztása révén. Ismeretes, hogy a vér vasat tartalmaz és ennek a vasnak a nagy része vas-protoporflrin formájában van jelen a hemoglobinban. Amikor a plazmát elválasztjuk a vérből, a vérben lévő összes fehérjének körülbelül a 80%-a marad vissza a vérsejt-frakcióban. A vérsejt-frakció körülbelül 38% nyers fehérje szárazanyagtartalmának a szarvasmarháknál körülbelü a 80%-át és a sertéseknél körülbelül a 87%-át. A hemoglobin tartalmaz körülbelül 6% hemet, amelynek körülbelül 9% a vastartalma, míg a fennmaradó 94%-nyi része a globin. A hemben szerves kötésben levő vas iránti érdeklődés nagymértékben megnövekedett, amióta' egyes tanulmányok szerint* azt figyelték meg, hogy az ilyen vas jobban adszorbeálódik a belekben, mint a szervetlen vasvegyületek. Továbbá bizonyos szervetlen vasvegyületekről azt találták, hogy ártalmas hatásaik vannak. Azonban a vérsejt-frakcióerős színe, szaga és íze, valamint a romlandósága következtében ennek gyógyászati vaspótló anyagként való felhasználása szóba sem jöhet. A hemet a globin tói már korábban is elkülönítették laboratóriumi méretben kromatográfiásan vagy extrakciós úton, amikor is oldószerként metil-etíl-ketont, acetont és dimetil-formamidot használtak. Az oldószeres eljárásoknak azonban technológiai méretben való alkalmazása számottevően nagy oldószer- és oldószerregenerálási költségeket eredményez. Emellett a felhasznált oldószerek igen gyúlékonyak és az oldószennaradékoknak a végtermékből való eltávolítása nehéznek bizonyult, ha a végtermékeket takarmányként, élelmiszerként vagy gyógyszerként használták fel. A svéd 7 407 882-5 számú nyilvánosságrahozatali irat ismertet egy eljárást a hemnek a globintól való elkülönítésére, amely módszer értelmében a savas hemoglobintól való elkülönítésére, amely módszer értelmében a savas hemoglobin oldatot lehűtik és ehhez az oldathoz két lépésben nagymennyiségű etanolt adnak azért, hogy a globint lecsapják és centrifugálissal elválasszák. Ennek az eljárásnak is hátránya azonban, hogy az oldószert nagy mennyiségekben szükséges használni, amelyet végül is a végtermékekből el kell távolítani. Emellett a műveletet kis hőmérsékleteken kell kivitelezni, ami tetemes járulékos kiadásokat okoz. Korábbról már ismeretes, hogy a vér globintartalmát a bemtől karboxi-metil-cellulóz segítségével kromatográfiásan választják el. Ezt az eljárást ismertető DE 3,102986 lisz. szerint a hemoüzált és savval hidrolizált vérsejt-frakciót egy karboxi-metil-cellulózzal töltött oszlopon vezetik át, amikor is a hem a karboxi-metil-cellulózhoz adszorbeálódik a globinnal együtt, mely utóbbit savas vizes oldattal eluálják. A hem is elválasztható egy újabb eluálási eljárással, azonban a mennyisége oly kevés, hogy ez a módszer technológiai léptékben nem alkalmazható. A jelen találmány tárgya, hogy egy módszert ismertessen a vér hemoglobinjának hem és globin részekre való szétválasztására, amely eljárásnál a fentebb említett módszerek hátrányait kiküszöböljük és amely eljárásnál a kapott végtermékek egyike egy olyan hemtartalmú anyag, amely nyersanyagként Használható fel gyógyászati vaspótló készítmény előállításához, valamint egy globin fehérje, amelyet élelmiszer vagy takarmány alkotórészeként lehet felhasználni az oldószerek által okozott hátrányok nélkül. A találmány fő jellemzőit a csatolt 1. igénypontban adjuk meg. A találmány szerint a vérplazmától elkülönített vérsejt frakciót vízzel való hígítás révén hemolizálva és 3 pH érték alatt savas vizes oldatban hem és globin részre való disszociáltatás után a savas rendszerhez a hemoglobinból disszociálódó nem rész mennyiségéhez elegendő karboxi-metii-cellulózt adva lecsapjuk a hem-karboxi-metil-cellulóz komplexet és ezt a csapadékot a globin-tartalmú vizes oldattól elválasztjuk. A karboxi-metil-cellulózt előnyösen dyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy a karboxi-metil-cellulóz globin súlyaránya 1:1000 — 2:10 között, vagy 1:10 - 2:10 között legyen. A karboxi-metil-cellulózt élőn) ösen vizes oldatában adjuk a hem és globin savas vizes rendszeréhez. A hem lecsapása folyamán a szuszpenzió pH-ját maximálisan 3 pH értéken tájijuk. A hemben levő vas valószínűleg koordinatív kötést hoz létre a karboxi-metil-cellulóz karboxil csoportjaival. Az alábbiakban a találmányt nagyobb részletességgel ismertetjük a kiviteli példák segítségével. 1 példa A vérpalzmától elválasztott, hemoglobint tartalmazó vérsejt-frakciót olyan mennyiségű vízzel hígítjuk fel, amelynek a súlya legalább a kétszerese a vérsejt-frakció súlyának és az így kapott oldathoz annyi 0,1 mólos sósav oldatot adunk, hogy a pH-ját olyan Ids értékre állítsuk be, hogy' amikor a karboxi-metil-cellulóz vizes oldatát hozzáadjuk ehhez az oldathoz, a vizes oldat pH-ja 3 alatt maradjon. A karboxi-metil-cellulóznak a dobin fehérjére vonatkoztatott súlyaránya körülbelül 1 ;10 legyen a vizes oldatban. A keletkezett csapadékot elválasztjuk a vizes oldattól 8000 g értékkel 15 percig tartó centrifugálással. A csapadék vastartalma 1,8% és a világos színű oldat a szárazanyag-tartalmára számítva maximális 0,07% súlyarányban tartalmaz vasat. 2. példa A vérplazmától elkülönített, hemoglobint tartalmazó véisejteket felszuszpendáljuk vízben, amikor is a súlyarány 1:2, Az oldat pH-ját 1 mólos sósav oldattal 1,5 értékre állítjuk be és karboxi-metil-cellulóz 0,3%-os vizes oldatát ötszörös térfogatmennyiségben adjuk hozzá a savas vizes oldathoz, amikor is a vizes oldatban a CMC-nek a globin fehérjére vonatkoztatott súlyaránya 2:10. A keveréket állni hagyjuk 15 percig és a kicsapódott hem-CMC komplexet elválasztjuk a globin fehérje oldattól 8000 g értéknél 0,5 órán át végzett centrifugálással. A fehérjefrakció az eredeti globin fehérjéknek körülbelül a 70%át tartalmazza és a szárazanyagának kevesebb, mint a 0,05 súly%-a a vas. 3. példa A plazmától elválasztott vérsejteket vízzel felhígítjuk 1:3 súlyarányban. Az oldat pH-ját 1 mólos sósav oldatta] 1,5 értékre állítjuk be és az oldat térfogatának négyszeres mennyiségét adjuk hozzá a karb-189.692 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
