189660. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,3,3a, 4,5,6,1H-hexahidro- indolo[3,2,1,-de]naftiridin enantiomerjeinek szétválasztására, és e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 agyi véredények károsodása és az öregkori agyérelmeszesedés okozta viselkedési zavarok kezelésére, továbbá agysérülésekből eredő eszméletvesztés, anyagcserével kapcsolatos agyvelőbántalmak, valamint depressziós állapotok kezelésére alkalmazhatók. A találmány tárgya továbbá minden olyan gyógyszerkészítmény, mely a találmány szerinti eljárással előállított (I) képlet ű vegyületek enatiomerjeit, vagy azok sóit hatóanyagként tartalmazza, valamely szokásos segédanyaggal együtt, amely a vegyületek mind orális, mind pedig parenterális alkalmazását lehetővé teszik. A készítmények akár szájon át, akár parenterálisan beadhatók. A napi adagolás 10-től 100 mg-ig terjedhet. összehasonlító farmakológiai vizsgálatokat végeztünk a 2 037 889 számú brit szabadalmi bejelentés 1. valamint az 1. és 3. példa vegyületeinek metánszulfonsavas sóival. A vizsgálatok eredményeit a táblázat mutatja be. Kétféle vizsgálatot végeztünk az alábbiakban leírt 1. és 2. pontban ismertetettek szerint. 1.) A fentiekben említett két vizsgálat közül az egyik a vizsgálandó vegyületek triptamin receptorokhoz kötődő ‘iH-triptaminra kifejtett gátló hatását vizsgáltuk in vitro. Ezt a vizsgálatot az alábbiak szerint végeztük: 150-200 g közötti súlyú hím. Sprague-Dawley patkányokat használtunk. Lefejezés után az agyat kimetszettük és az agykérget^kiboncoltuk. Minden további műveletet 0 WC és 4 °C közötti hőmérsékleten végeztünk, hacsak másképp nem jeleztük. A szövetet 50 mmól/lit trisz-hidroxi-metil)-aminoetán-hidroklorid, 5 mmól/lit aszkorbinsav és 10 mmól/1 pargilin tartalmú pufferben politronnal homogenizáltuk. A szövethormogenizátumot kétszer egymás után 10 perces centrifugálással (48,000xg) és a szilárd maradék friss pufferben való szuszpendálásával mostuk. A kapott szilárd anyagot újból fevettük oly módon, hogy a nedves anyag 50 mg-ját 1 ml friss pufferban szuszpendáltuk, hogy kezdeti koncentrációjú mintát kapjunk, majd azt 37 °C hőmérsékleten. 5 percig előinkubáltuk. Ezt a membránkészítményt ^H-triptaminnal (a New England Nuclear cég 39,5 Ci/mmól specifikus aktivitású készítménye), a pufferral 1 ml végtérfogatra hígítva a jelöletlen gyógyszer jelenlétében vagy anélkül inkuböltuk. 0 °C hőmérsékleten 60 percig tartó inkubálás után az inkubált elegyhez 4 ml jéghideg puffert adtunk, majd Whatman GF/B porózus-végszűrőn gyorsan átszűrtük. Ezt követően a szűrőket a jéghideg puffer háromszor 4 ml térfogatú részleteivel mostuk, szárítottuk, majd számláló fiolákba helyeztük. A szűrő által visszatartott, membránhoz kötött radioaktivitást folyadék sdntillációs spektroszkópiai úton határoztuk meg, miután a szűrőt toluol-PPO-POROP alapú sdntillációs folyadékkal extraháltuk. A nem spedfikusan a szövethez és a szűrőhöz kötődő ^H-triptamin mennyiségét mint az inkubálás során 10 mmól jelöletlen triptamin jelenlétében megfigyelt visszamaradó kötődést határoztuk meg. A jH-triptamin, triptamin receptorokhoz való specifikus kötődését úgy számoltuk, hogy a nem specifikus kötődést kivontuk a szűrőn a jelöletlen vegyület nélkül, vagy a tanulmányozott vegyület jelenlétében visszatartott teljes radioaktivitás mennyiségéből. A tanulmányozott vegyület koncentráció-függő, a JH-triptamin specifikus kötődését gátló hatásátá a hagyományos grafikus és a legkisebb négyzetek módszerén alapuló lineáris regresszió számítással határoztuk meg. Az eredményeket ICjQ értékben, azaz a ^H-triptamin kötődését 50%-kaI gátló hatóanyagkoncentrációiban fejeztük ki. 2. A másik említett vizsgálati módszerrel a vegyületeknek a JH-prazosin űii-adranorecepírokhoz való kötődését gátló hatását határoztuk meg in vitro. Ezt a vizsgálatot az alábbiak szerint végeztük: 150-200 g közötti súlyú, hím Sprague-Dewley patkányokat használtunk. Lefejezés után az agyat kimetszettük és az agykérget kiboncoltuk. Minden további eljárást 0 °G és 4 C közötti hőmérsékleten végeztünk, hacsak másképp nem jeleztük. A szövetet 50 mmól/1 töménységű trisz(hidroxi-metil)-aminoetán-hidroklorid pufferten politronnal homogenizáljuk. A szövet homogenizátumot kétszer egymásután 10 percig tartó centrifugálással (30.000xg) mostuk oly módon, hogy az egyes centrifugáiások után kapott labdacs 10 mg nedvessúlyú részét 1 ml pufferten szuszpendáltuk, hogy kezdeti koncentrációjú mintát kapjunk. Ezen membrán készítmény JH-prazosinnal (a New England Nuclear cég 25,4 Ci/mm spedfikus aktivitású készítménye) inkubáltuk, 1,05 túl végtérfogatú pufferban a jelölt gyógyszerek jelenlétében, vagy anélkül. 30 perdg tartó 25 °C hőmérsékleten történő inkubálás után az inkubált elegyet 3 ml jéghideg pufferrel hígítottuk és Whatman GF/B porózus üvegszűrőn gyorsan szűrtük, A szűrőket egymásután kétszer 5 ml jéghideg pufferrel mostuk, szárítottuk és számláló fiolákba helyeztük. A szűrő által visszaszorított radioaktivitást toluol-PPO-POROP alapú szcintilládós folyadékot használva, folyadékszcinülládós spektroszkópiai úton határoztuk meg. A JH-prazosin a szövethez és a szűrőhöz való nem specifikus kötődését, mint az inkubáció folyamán 10 mmól/1 fentol-amin jelenlétében megfigyelt visszamaradó kötődést határoztuk meg. A JH-prazosin oti -adrenerg receptorokhoz való fajlagos kötődését úgy számítottuk ki, hogy a nem specifikus kötődést kivontuk a szűrő által a jelöletlen vegyület nélkül vagy a vizsgált vegyület jelenlétében visszatartott radioaktivitásból. A^H-prazosin kötődését gátló vizsgált vegyület által kifejtett hatás koncentrációfüggését hagyományos grafikus és a legkisebb négyzetek módszerén alapuló lineáris regresszió számítással határoztuk meg. Az eredményeket IC^q értékekben, azaz a gyógyszer azon koncentrációiban határozuk meg, amely a specifikus 'fil-prazosin kötődést 50%-ka gátolja. A táblázatban a kapott eredményeket minden égyes vegyületre vonatkozóan ICjq formájában adjuk meg, a gátló hatás a JH-triptaminra vonatkozóan (A) jelzéssel, gátló hatás a .JH-prazosinra vonatkozóan (B) jelzéssel, valamint a JH-prazosinra és a JH-triDtaminra vonatkozó JCjq hányadosait (B/A) jelzéssel. Amennyiben a ^H-p jazosin kötődésére vonatkozó ICjq értéket mint az R -adrenerg receptorokra kifejtett gátló hatás értékét, a JH-triptaminra vonatkozó IC c g értékét pedig a triptaminerg receptorokra kifejteti gátló hatás értékeként vesszük, ezek hányadosát pedig mint a triptaminerg neurotranszmisszióra kifejtett hatás szelektivitásaként értékeljük. A találmányunk első példája szerinti vegyület körülbelül 3,5-szer szelektívebb, mint a 2 087 889 számú brit szabadalmi leírás 1. példája szerinti vegyület és a ta-189.660 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
