189609. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusellenes hatású új purin-származékok és az ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 189 609 2 17. példa A 7S9U vegyidet ln vitro hatékonysága a Herpes simplex 1. típusú vírussal szemben. Módszer 60 mm méretű műanyagcsészékre sejtszuszpenziót oltottunk (2x10| sejt/ml koncentrációjú szuszpenzióból 60 ml-t) VERŐ tápfolyadékban, mely 5% foetális borjúszérumot, 10% Eagles minimális esszenciális közeget, 0,11% nátrium-hidrogén-karbonátot, 0,25% crystamicint (50 000 egység/ml nátrium-benzil-penicillin B. P. és 50 mg/ml sztreptomicinszulfát B. P.) tartalmazott. A csészéket enyhén rázattuk, hogy biztosítsuk a sejtek teljes diszpergálását, és ezután a tenyészeteket 37 C hőmérsékleten inkubáltuk 5% C02/levegő atmoszférában éjszakán át, az elfolyósodás elérése céljából. A tenyészközeget ezután kiegészítettük 2 ml Herpes simplex I. típusú vírus inokulummal, foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban. A vírusok koncentrációját úgy állítottuk be, hogy 200 400 plakkot képezzenek csészénként. A vírusok felszívódására 1 órát hagytunk 37°C hőmérsékleten 5% C02/levegő atmoszférában, ezután a csészéket leszivattuk. és 42°C hőmérsékleten 8 ml közeggel felülrétegeztük. A felülrétegezésre alkalmazott közeg összetétele a következő volt: 0,6% agaróz, 2% foetális borjúszérum, 10% Eagle minimális esszenciális közeg, 0,11% nátrium-hidrogén-karbonát és 0,25% crystamicin. A hatóanyag mikromolaritásában számítva kétszeres hígításokat készítettünk a felülrétegezett közegben, és a tenyészeteket kétszeres ismétlésben fenntartó közeggel láttuk el, mely a hatóanyag koncentráció-sorozatát láttuk el, mely a hatóanyag koncentráció-sorozatát tartalmazta. Ezen kívül kezeletlen víruskontrolltenyészeteket és nem-fertőzött tenyészeteket is készítettünk. A felülrétegezett köze get szobahőmérsékleten hagytuk megszilárdulni, mielőtt a tenyészeteket visszahelyeztük az inkubáló berendezésbe 37°C hőmérsékleten, 5% C02/levegő atmoszférában 4 napon át. Ezután a tenyészeteket 30 perctől 1 óráig terjedő időtartammal fixáltuk foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban levő 10% formalinnal, a felülrétegezett közeget eltávolítottuk, és a sejteket 20%-os metanolban oldott 0,05 súly/ térfogat% metilibolyával megfestettük. Az így kapott plakkokat megszámoltuk, és a kezeletlen vírus-kontroli tenyészeteket plakkszámának százalékban fejeztük ki. Ezeket az értékeket ábrázoltuk a hatóanyag koncentrációja 10-es alapú logaritmusának függvényében, és az így kapott dózis-válasz görbéből olvastak le az IC50 értékeket, azaz a hatóanyagnak azon mennyiségét, mely a plakkok számának 50%-kal való csökkentéséhez szükséges. Eredmények 759U Acyclovir IC|o fJM ICSo/iM 1. kísérlet 0,09 0,17 2. kísérlet 0,05 0,075 3. kísérlet 0,036 0,11 Átlag 0,059 0,118 Következtetés A 759U vegyület erélyesebb hatást fejt ki in vitro a Herpes simplex I. típusú vírusra, mint az acyclovir. 18. példa A 759U vegyület in vivo hatékonysága a herpeszes agyvelőgyulladasra Vírus-törzsoldat készítése 12-15 g testsúlyú svájci egereket éterrel elaltattunk, és intracerebrálisan 0,025 ml I. típusú herpesz-vírusból készült szövettenyészettel oltottunk. Az egereket naponta megvizsgáltuk a herpeszes agyvelőgyulladás jeleinek szempontjából, tehát figyeltük az agyi sérülésnek olyan jeleit, mint a paralízis, kóma és elhullás. Az egereket akkor öltük le, amikor az agyi sérülés korai tünetei jelentkeztek. Az egerek zsigerein megvizsgáltuk a baktériumos fertőzések jeleit, és ha normálistól eltérőt nem találtunk, akkor aszeptikus módon eltávolítottuk az agyvelőjüket, és egyenletes pasztává porítottuk. Ezt a homogenátumot 4 ml fenntartó közeggel szuszpendáltuk (minden egyes agyvelőre számítva), majd 2 : 1 arányban glicerinnel kevertük. Mivel az egér agyveleje megközelítőleg 400 mg, az így előállított készítmény 10'1 hígítást jelentett. Az így előállított vírus-törzsoldatot egeteken titráltuk az LD50 titer meghatározása végett úgy, hogy az egereket intracerebrálisan oltottuk a vírus-törzsoldat tízszeres hígításával, majd ezt követően naponta kétszer megfigyeltük a fertőzés tüneteit. Az LDSo titert Karber módszerével számítottuk ki. Módszer 5 egérből álló csoportokat intracerebrálisan fertőztünk a vírus-törzsoldattal, olyan hígításban, hogy a dózis kereken az LDS0 érték 300-szorosa legyen. A vizsgálandó hatóanyagot naponta kétszer adagoltuk, szuszpenzió formájában, orális úton, 100 mg/kg dózisban. Az állatokat naponta kétszer vizsgáltuk, és a legközelebbi fél napon feljegyeztük a túlélési időket. A hatóanyagok adagolásai 5 napon át végeztük, a megfigyelés teljes időtartama 14 nap volt. A túlélési időket reciprok értékekké alakítottuk, és minden egyes csoport esetében meghatároztuk az átlagos túlélési időtartamot [L. Bauer: Brit. J. Exp. Path. 41, 130 (1960)1. Acyclovir 759U Kontroll A túlélési idő reciprokának átlaga 0,26 0,15 0,33 Következtetés A 759U vegyület, intracerebrálisan fertőzött egereken orálisan adagolva sokkal erősebb hatást fejtett ki, mint az acyclovir ugyanilyen körülmények között. 19. példa A 759U és 457U herpeszes agyvelőgyulladásra kifejtett in vivo hatékonyságának összehasonlítása A 759U és 457U hatóanyagokat in vivo egereken vizsgáltuk a herpeszes agyvelőgyulladással szemben, összehasonlítva egyrészt az acyclovir, másrészt a 6-amino-analóg, azaz a 2-amino-9-(2-hidroxi-metoxi-metil)-adenin ( 134U) hatásával. 16—20 g súlyú CD-I- egereket (Charles River, Mansion, Kent, Nagy-Brittania) megközelítőleg 10-es csoportokban helyeztünk el, és az álatoknak ad libi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
