189600. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új policiklusos éter-származékok és az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 . 189 600 2 valamint egy-gyomrú állatok, így sertések, nyulak esetében egyaránt. Az 53,607 antibiotikum belekeverhető az állati takarmánykeverékbe szabad sav, nátrium só, kálium só, vagy ezek keveréke formájában. Az 53,607 antibiotikum nyers formája, vagy 5 az antibiotikumot tartalmazó szárított fermentációs táptalaj szintén belekeverhető az állati eleségbe, a kívánt koncentrációban. Az alább következő példák a találmány szerinti eljárást illusztrálják anélkül, hogy az oltalmi kört 10 ezekre a példákra korlátoznánk. 1. példa Oltóanyag 15 20 25 A következő összetételű steril vizes tápközeget készítjük el: .Adalékanyag gramm/liter Keményítőcukor 10 Keményítő 20 Élesztő extraktum 5 NZ Amin YTT* 5 Dinátrium-hidrogén-foszfát 0,5 Húsliszt 5 Kobalt-klorid 0,002 Kalcium-karbonát 4 pH = 7,1-7,2 Streptamyces halstedii ATCC 31812 ferde tenyészetéből származó sejteket egy sorozat 300 ml-es 30 lombikba helyezünk, amelyek mindegyike 40 ml-t tartalmaz a fenti steril táptalajból, és egy forgó rázógépen 28-36 °C hőmérsékleten 3-4 napig rázzuk őket. Fermentáció A kifejlődött tenyészet megfelelő mennyiségét, ami 2 térf% oltóanyag biztosításához elegendő, négy literes fermentorokba helyezzük, amelyek mindegyike két liter, az alábbi összetételű steril tápközeget tartalmazza: A dalékanyag gramm/liter Keményítőcukor 10 NZ Amin A* 5 Keményítő 20 Élesztő extraktum 5,0 45 Kálcium-karbonát 1,0 Kobalt-klorid 0,002 Víz, 1000 ml-es össztérfogathoz * = Enzimatikusan lebontott kazein bejegyzett márkaneve, Humko Sheffield Chemical Co., Inc. 50 A fermentációt 30 °C-on, 1700 fordulat/perc (RPM) keverési sebességgel, a táptalaj térfogategységére vonatkoztatva percenként egy térfogategység levegővel történő levegőztetéssel, addig folytatjuk, amíg elegendő aktivitás figyelhető meg (a vizs- 55 gálati módszer: antibiotikus korong vizsgálat, B. subtilis ATCC 6633**-vel szemben), ez a jelen esetben 3 nap volt. Az egész táptalajt semleges pH- értéken leszűrjük, szűrő - Supercel vagy Celite 35 40 segítségével, a szürletet metil-izobutil-ketonnal vagy n-butanollal extraháljuk. A szerves fázist elszívással elválasztjuk a vizes fázistól, és leszűrjük, a szuszpendált .anyag eltávolítása céljából. A szűrőpogácsát metanollal feliszaposítjuk, szűrjük, a metanolt elpárologtatjuk és a maradékot ugyanaz-60 65 zal az oldószerrel extraháljuk, amit a leszűrt táptalaj extrakciójához használtunk. Az extraktumokat egyesítjük, és vákuumban bepároljuk, míg egy viszkózus olajat kapunk. Az olajat heptánban szuszpendáljuk, szilikagéllel összekeverjük és szűrjük. A szűrőpogácsát ismételten heptánnal mossuk és a terméket lépésről-lépésre kloforommal, kloroform és etilacetát keverékével, majd végül etilacetáttal eluáljuk. A frakciók vékonyréteg kromatográfiája (TLC) és biológiai vizsgálata után, az aktív frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, és a maradékot újra kromatografáljuk, ily módon szilárd anyagként megkapjuk az 53,607 antibiotikumot. Infravörös spektrum (KBr) mikron: 2.95, 3.42, 6.00, 6.37, 6.85, 7.14, 7.30, 7.65, 7.90, 8.10, 9.05, 9.15, 9.67, 10.00, 10.18, 10.53, 11.15, 11.40, 11.75, 13.25. Az anyag kloroformban, etil-acetátban, metanolban és metil-izobutil-ketonban oldódik; vízben oldhatatlan. *.* A táptalaj és az átfolyás után kinyert folyadék bioaktivitását egy érzékeny Bacillus subtilis ATCC 6633 vagy Staphylococcus aureus ATCC 6538 törzs felhasználásával ellenőrizzük. A táptalaj és az átfolyás után kinyert folyadék komponenseit szilikagél lemezeken hívjuk elő a futtatáshoz 9:1 arányú etilacetát/metanol vagy 9:1 arányú kloroform/metanol elegyet használunk és a lemezt vanillinnel befújjuk (3 g vanillin 97,0 ml etanolban és 3,0 ml koncentrált kénsavban feloldva), majd 80 °C-ra melegítjük. A 53,607 antibiotikum pirosas foltként jelentkezik. Vagy, a lemezt agarral beborítjuk, beoltjuk olyan S. aureus-sza\ vagy B. subtilis-szál, amelyhez 1,0 ml 1 %-os tétrazolium oldatot adtunk, és 37 °C-on 16 óra hosszat inkubáljuk, az antibiotikum előhívása céljából (világos területek piros háttér mellett). 2. példa Az oltóanyagot az előző példában leírtak szerint készítjük el, azzal a különbséggel, hogy lombikonként 700 ml tápközeget használunk, a rázott lombikos oltóanyagot - amelyet két oldalcsonkos edényben készítünk össze - 3-4 napig, 28 'C-on fermentáljuk. Egy 6420 literes fermentort, amely 4530 liter, az alábbi összetételű steril tápközeget tartalmazott, 10 liter (0,1%), fent leírt oltóanyaggal beoltunk. Fermentációs tápközeg Alkotórész gramm/liter Keményítőcukor i?o Kazein ő’o Keményítő 5,0 Kukorica áztató folyadék s’o ml Kálcium-karbonát 3,0 Kobalt-klorid 0,002 Víz, 1 literhez pH = 6,9-7,0 A fermentort 28 °C hőmérsékleten tartjuk, levegőztetéssel és 1700 fordulat/perc sebességű keveréssel. 120 óra után a fermentor tartalmát feldolgozzuk. Az egész táptalajt (4530 liter) 945 liter metilizobutil-ketonnal extraháljuk, a rétegeket egy extraktorban (Podbielniak) elválasztjuk, és a szerves 8
