189600. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új policiklusos éter-származékok és az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 .189 600 2 szetnek a köz számára való hozzáférhetősége a szabadalom megadása után a szabadalom egész oltalmi idejére kiterjed. Amíg a szabadalmi bejelentés függőben van, a tenyészethez 37 CFR 1.14 és 35 USC 112 hivatkozási számmal lehet hozzáférni. A hozzáférhetőség minden korlátozása megszűnik a szabadalom megadásával. A Streptomyces halstedii ATCC 31812 tenyésztését olyan körülmények között végeztük, amelyek hasonlóak a poliéter antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok fermentációs körülményeihez. Ilyen fermentációról ir a 4 195 079 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás. A tenyésztést előnyösen vizes tápközegben, süllyesztett aerob körülmények között, keverés mellett, 24 °C-36 °C hőmérsékleten hajtjuk végre. A tenyésztéshez használt tápközeg emészthető szénforrás, így cukrok, keményítők és glicerin; szerves nitrogénforrás, így kazein, kazein enzimatikus kivonata, durva szójaliszt, durva gyapotmagliszt, durva mogyoróliszt, búzaglutén, finom szójaliszt, húsliszt és halliszt lehet. Növekedést elősegítő anyagokként előnyösen gabonaoldatokat és élesztökivonatot, valamint sókat, így nátrium-kloridot és kálcium-karbonátot, nyomelemeket, így vasat, magnéziumot, cinket, kobaltot és mangánt alkalmazhatunk. A fermentáció alatt intenzív habzás következik be, ezért a fermentációs közeghez habzásgátló anyagokat, így növényi olajokat vagy szilikonokat adhatunk. A fermentorokban a közeg levegőztetését előnyösen úgy oldhatjuk meg, hogy a fermentációs táptalaj térfogatára nézve körülbelül 1/2-2 térfogat steril levegőt áramoltatunk át percenként a táptalajon, egy levegőeloszlató segítségével. A keverést a fermentációs iparban ismert keverők felhasználásával biztosíthatjuk. A keverés sebessége az alkalmazott keverő típusától függ. Egy rázó-lombik általában 150-200 percenkénti fordulatszámmal forog, míg egy fermentor keverője általában 300-600 percenkénti fordulatszámmal. Természetesen fontos az aszeptikus körülmények fenntartása az egész tenyésztés alatt. A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikum előállításához szükséges oltóanyagot egy ferde tenyészetből származó anyagból nyerhetjük. Az oltáshoz használt anyag tenyésztése lehet rázólombikban vagy inokulum fermentorban, vagy az inokulum ferinentort beolthatjuk a rázó-lombikból. Rázó-lombikokban a növekedés maximális értéke 2-4 nap alatt érhető el, míg az oltóanyag süllyesztett inokulum fermentorokban általában 1 1/2-3 nap alatt éri el legelőnyösebb periódusát. A fermentáció alatt az antibiotikum termelés előrehaladását és a fermentációs táptalaj bioaktivitását a táptalaj biológiai vizsgálatával ellenőrizhetjük, egy érzékeny Staphylococcus aureus vagy Bacillus subtilis törzs felhasználásával. Erre a célra a S. aureus ATCC 6538 és B. subtilis ACCC 6633 törzsek megfelelőek. Lemezes vizsgáló módszert alkalmazunk, amelyben a táptalajjal átitatott szűrőpapír gyűrű által körülvett gátló zónát használjuk az antibiotikus hatóképesség mértékéül. Szilikagéles vékonyréteg kromatográfia is használható a fermentációs közegben termelődött antibiotikum és a fermentációs táptalajból extrahált nyers és tisztított anyagok összetételének analizálására. Az Analtech szilikagél GF kromatogramokat etilacetát/metanollal (9:1) vagy kloroform/metanollal (9:1) futtatjuk. Az antibiotikumot előhívhatjuk oly módon, hogy a lemezt vanillin etanolos kénsavas oldatával (3 g vanillin 97 ml etanolban és 3 ml koncentrált kénsavban oldva) befújjuk és 80 °C-ra melegítjük. Az antibiotikum mint pirosas folt jelentkezik. Az antibiotikum előhívását úgy is elvégezhetjük, hogy a lemezt S. aureus-szál vagy B. subtilis-sza\ beoltott agarral vonjuk be és 37 °C-on 16 óra hosszat inkubáljuk. Az S halstedii ATCC 31812 fermentációjával termelt antibiotikumot a szüretien fermentációs táptalajból valamilyen szerves oldószerrel, így kloroformmal, etil-acetáttal, metil-izobulil-ketonnal vagy butanollal, a természetes pH értéken történő extrahálással választhatjuk el és nyerhetjük ki. Az oldószeres extraktumot ezután vákuumban híg sziruppá koncentrálhatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikum - a továbbiakban „53,607 antibiotikum” elválasztására és kinyerésére tipikus módszer az alábbi: Az 5. halstedii ATCC 31812 fermentációjából származó teljes táptalajt metil-izobutil-ketonnal e araháljuk. Az oldószeres extraktumból vákuumdesztillációval eltávolítjuk az oldószert, így egy sötét olajat kapunk. Ezt az olajat kloroformban oldjuk és szilikagél ágyra öntjük. Ezután a szilikagél ágyat egymás után kloroformmal, etil-acetáttal és acetonnal mossuk. A mosófrakciókat vékonyréteg-kromatográfiával vizsgálva, az etil-acetátos frakcióban csaknem kizárólag 53,607 antibiotikumot :alálunk. Az etil-acetátos frakciót szárazra pároljuk, a többi frakciót kiönjük. A száraz etil-acetátos frakciót oszlopkromatográfiásan tisztítjuk oly módon, hogy etil-acetáttal felhígítjuk és etil-acetáttal e'iszaposított szilikagéllel töltött oszlopra öntjük, és etil-acetáttal eluáljuk. A vékonyréteg kromatográfiás vizsgálattal meghatározott, 53,607 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd bepárlással csökkentjük a térfogatot. Ezt az anyc got ezután Sephadex LH-20 metanolos töltettel megtöltött oszlopon kromatografáljuk, az 53,697 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett térfogatúra bepároljuk, majd kloroformmal felhígítjuk. A kloroformos oldatot foszTorsavval pH = 4,5 értékűre beállított 5%-os mononátrium-foszfát púderrel mossuk. Az oldószeres fázist ezután 5 s/v %-os dinátrium-foszfát puferrel mossuk, amelynek pH-ját nátrium-hidroxid oldattal pH = 9,0 értékre állítjuk be. Az oldószeres fázist ezután vízmentes nátrium-szulfát felett szár tjük, és bepároljuk. A maradékot acetonban feloldjuk és hűtőszekrénybe helyezzük, ahol is az 53,607 antibiotikum nátriumsó formájában kikristályosodik. A szabad savat megkapjuk, ha a nátrium >ó etil-acetátos oldatát pH = 4,5 értékűre beállított vízzel mossuk. Az oldószer elpárologtatása utál megkapjuk az 53,607 antibiotikum kristályos szabad savas formáját. Az 53,607 antibiotikum analízise az (I) képletü szerkezetet bizonyította. Az 53,607 antibiotikum gátló hatást mutat számtala í Gram-pozitív mikroorganizmussal szemben. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
