189552. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a D,L-2-amino-4-metil-foszfino-vajsav szétválasztására enzimatikus úton
1 139 552 2 A találmány tárgya eljárás a D,L-2-amino-4- metil-foszfino-vajsav szétválasztására enzimes úton. A D,L-2-amino-4-metil-foszfino-vajsav (a továbbiakban L-foszfino-tricinnek, illetve L-PTC-nek nevezzük) vagy ennek szerves vagy szervetlen bázisokkal vagy savakkal képzett sói - mint az a 2 939 269 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratból ismertté vált - a kémiailag könnyen hozzáférhető racemátok hatásos komponensei. A racemátok a 27 17 440 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat szerint számos egyszikű és kétszikű, egyéves vagy több éves gyommal szemben erős herbicid hatásúak. Mivel az L-PTC és az említett származékai kétszer olyan hatásosak, mint a racemátok, szükséges volt olyan eljárás kifejlesztése, amellyel az L-PTC egyszerűen, nagy mennyiségben előállítható. Az L-PTC-t már előállították az irodalomból ismert, mikrobiológiai úton előállított antibiotikum, az L-PTC-alanil-alanin savas hidrolízisével [73-85 538 számú japán közrebocsátási irat] vagy enzimatikus lebontásával [74-31 890 számú japán közrebocsátási irat], A 29 39 269 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat olyan eljárást ismertet, amelynek során az N-acil (különösen N-acetil)-LPTC-t speciálisan tenyésztett Pseudomonas, Streptomyces vagy Aspergillus törzsekből származó, egész sejtek vagy sejtextraktumok formájában jelenlévő mikrobás acilázokkal gyorsabban hasítják, mint a D-származékot. A közrebocsátási irat szerint az alkalmazott acilázok alig vagy nagyon kis mértékben hatásosak az N-acil-L-PTC-től eltérő egyéb szubsztrátumokkal, például az ismert, általánosan alkalmazott L-aminosavak N-acil-származékaival szemben. A feldolgozás után izolált PTC maximális fajlagos forgatóképessége [a]ß = 23° (c=l, 1 n HC1), ennek alapján optikai tisztasága mintegy 75%. A vizsgálatok azt mutatták, hogy a szokásos kereskedelmi acilázok - mint az Acylase I (sertésveséből izolált aminoaciláz, EC 3.5.1.14) vagy a mikrobás AMANO-aciláz - amelyek a természetes aminosavaknál jól alkalmazhatók a racemátok szétválasztására, a D,L-acil-PTC-nél hatástalanok. Ezt a 29 39 269 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat adatai is megerősítik amelyek szerint a PTC-aktív acilázok előállítású hoz költséges mikrobiológiai szűrés szükséges A hagyományos D,L-aminosavaknál nagy aktivitást és szelektivitást mutató egyéb enzimek - példá ul az észteráz aktivitású proteolitikus enzimek - sem aktívak illetve sokkal kisebb hatékonyságúaf a D,L-PTC-észtereknél. Azt tapasztaltuk, hogy a Penicillin-G-aciláz ? fenacetilezett D,L-PTC-t nemcsak a természetes Penicillin-G-hez közel eső nagy reakciósebességgel dezacilezi, hanem a 29 39 269 számú német szövet ségi köztársasági közrebocsátási iratban ismertetet , mikrobás acilázhoz képest lényegesen nagyobb szelektivitással rendelkezik és ennek következtében a kapott L-PTC rendkívül nagy tisztaságú. A találmány tárgya ennek megfelelően eljárás a D,L-2-amino-4-metil-foszfino-vajsav szétválasztására enzimatikus úton, amelyre az jellemző, hogy a (1) képletü D,L-2-amino-4-metil-foszfino-vajsav- N-fenacetil-származékot 20—40 °C hőmérsékleten g vizes közegben E. coliból származó Penicillin-G- 3 acilázzal dezacilezzük és a reakcióelegyből az L-2- amino-4-metil-foszfino-vajsavat ismert módon izoláljuk. Ismert, hogy bizonyos fenacetilezett hagyomá- 10 nyos D,L-aminosavak az E. coliból nyert Penicillin u acilázzal szelektíven a szabad L-aminosavvá hidrolizálhatók [1 369 462 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás, Bioorganiceskaja Khimia 5, 604 ff (1979)]. Az is ismert azonban, hogy a szubsztrátum 15 aminosavrészének változtatásával a Penicillin-G- aciláz enzimatikus aktivitás lényegesen csökken [A. Plaskie et al., J. Antibiotics 31, 782 (1978)]. így nem volt várható, hogy a találmány szerint alkalmazott Penicillin-G-acilázzal az L-PTC nagy tiszta- 2Q ságban állítható elő. A találmány szerinti eljárásban L-PTC és N- fenacetil-D-PTC, valamint fenil-ecetsav keverékét kapjuk, amelyből az L-PTC ismert módon könynyen elválasztható. így például - adott esetben 25 szűrés után - a vizes reakcióelegyet H'+ '-formában lévő erős savas kationcserélő gyantával töltött oszlopon vezetjük át. Míg az N-fenacetil-D-PTC és a fenil-ecetsav átmegy az oszlopon, addig az L-PTC adszorbeálódik. Az L-PTC-t ezután ismert módon 30 híg sósavval vagy ammóniával eluáljuk. Az eluátumot adott esetben aktív szénnel tisztítjuk, majd fagyasztva szárítjuk vagy a bepárolt eluátumot kristályosítjuk. Az (1) képletü kiindulási anyagot ismert módon, 35 például a D,L-PTC dinátriumsójának - 5 °C és + 5 °C közötti hőmérsékleten fenacetil-kloriddal végbemenő reakciójával, akvimoláris mennyiségű nátrium-hidroxid adagolásával egyidejűleg állítjuk elő. A kapott reakcióelegyet ezután közvetlenül 40 szétválaszthatjuk; kívánt esetben az N-fenacetil-D, L-PTC-t sósavval vagy kénsavval történő megsavanyitással kristályos alakban is kinyerhetjük. Az N-fenacetil-D-PTC-t, amelyet enzimatikus úton nem választunk el, a fenil-ecetsav elválasztása után 45 éterrel vagy diklór-metánnal végzett hidrolízissel (híg sósav, 80 °C hőmérséklet) a D-PTC-vé alakíthatjuk, majd ezt racemizálás után ismét enzimatikus elválasztásnak vetjük alá. A Peniciilin-acilázok, illetve -amidázok olyan en- 20 zimek, amelyekkel a penicillin 6-amino-penicillánsavvá hasítható. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható Penicillin-G-acilázokat a prokarionte mikroorganizmusok - mint az Escherichia coli, a Bacillus megatherium - termelik [M. Cole et al., 55 Meth. Enzym. 43, 698 (1975)] és az E. C. Nr. 3.5.1.11. szám alatt ismertek. Különösen előnyös az E. coliból (ATCC 11 105) származó Penicillin-G-amidáz. A találmány szerint alkalmazott Penicillin-G- acilázokat szabad, vízoldható liofilizátum vagy víz- 60 ben oldhatatlan alakban hordozóhoz kötve (27 32 301 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat) vizes oldatban használjuk. A vizes oldat szubsztrátumkoncentrációja 0,1-20%^ előnyösen 4-6%. A reakcióhőmérséklet 65 2
