189548. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-4696 antibiotikum-komplex és egyes komponenseinek előállítására
1 189 548 2 különítsük el, az alkalmazott mikroorganizmusok aránylag széles pH-tartományban tenyészthetők. Kívánatos azonban a mikroorganizmus kb. 6,5-7,0 pH-jú táptalajban való tenyésztése. Mint más Actinomyceták esetében is, a növekedési közeg pH-ja a növekedési periódus alatt folyamatosan változik. A fermentációs periódus végén a pH értéke rendszerint a kb. 6,5-7,5 tartományba esik. Az A-4696 antibiotikum komponensek előállítására előnyösen süllyesztett fermentációs körülményeket alkalmazunk. A rázott lombikban való tenyésztéssel aránylag kis mennyiségű antibiotikum termelhető. Nagy mennyiségek előállítására ezért előnyben részesítjük a steril fermentorokban végzett süllyesztett aerób tenyésztést. A steril fermentorban jelenlevő táptalaj micélium-töredéket tartalmazó szuszpenzióval oltható be. Ennek megfelelően célszerű előállítani a mikroorganizmus vegetatív inokulumát oly módon, hogy aránylag kis mennyiségű táptalajt beoltunk a mikroorganizmus micélium-fragmentumával és amikor fiatal, aktív vegetatív tenyészetet kapunk, ezt sterilen átvisszük a nagy fermentorba. A táptalaj, amelyben a vegetatív inokulumot tenyésztjük, azonos lehet azzal, amelyet az A-4696 antibiotikum komponensek nagyüzemi előállítására használunk, azonban más táptalajokat is alkalmazhatunk. Az ATCC 31680, ATCC 31682 és ATCC 31683 Actinoplanes missoriensis törzs, amely A-4696 antibiotikum komponenst termel, 20-40 °C közötti hőmérsékleteken növekszik. A legnagyobb menynyiségű A-4696 antibiotikum komponens a megfigyelések szerint kb. 30 °C hőmérsékleten termelődik. A süllyesztett aerób tenyésztési eljárás során a táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A táptalajba bevitt levegő térfogata kb. 0,1-kb. 1,0 térfogat levegő/perc/táptalaj-térfogat között változtatható. A leghatékonyabb növekedés és antibiotikumtermelés akkor érhető el, ha a levegő térfogata legalább 0,5 térfogat/perc/táptalaj-térfogat. Az A-4696 antibiotikum komponensek képződési sebességét és a táptalaj antbiotikum-koncentrációját a növekedési szakaszban oly módon követhetjük, hogy megvizsgáljuk a fermentléből vett minták antibiotikus aktivitását egyes mikroorganizmusokkal szemben, amelyekről ismeretes, hogy érzékenyek az antibiotikumra. Egyik ilyen vizsgálati mikroorganizmus, amely felhasználható a találmány szemléltetésére, a Bac. subtilis. A biológiai vizsgálatot a szokásos gyűrű-lemez eljárással, vagy agar-lemezeken végzett papírkorong próbával végezhetjük. Az antibiotikum maximális termelése általában kb. 4-6 napon belül következik be rázott lombikokban vagy süllyesztett aerób fermentációban. Az A-4696 antibiotikum - a B„ B2, B3, Cla, C3 és E, antibiotikum komponensek további elkülönítése céljából - izolálható a fermentléből és elválasztható más anyagoktól, amelyek esetleg jelen vannak. Erre a célra adszorpciós és extrakciós technikákat alkalmazhatunk. Előnyben részesítjük az adszorpciós megoldásokat, mivel ezekkel az eljárásokkal nem jár együtt nagy térfogatú oldószerek felhasználása, az extrakciós eljárásoktól eltérően. Mivel a találmány szerinti eljárás szemléltetése lényegében ugyanazokra a szempontokra kell, hogy vonatkozzék, akár ATCC 31680 törzset (az A-4696 antibiotikum B2 és C3 komponense elkülönítésére), akár ATCC 31682 törzset (az A-4696 antibiotikum B, és Cla komponense elkülönítésére), akár ATCC 31683 törzset (az A-4696 antibiotikum B3 és E, komponense elkülönítésére) alkalmazunk, egyszerűség kedvéért itt csupán az ATCC 31683 törzs alkalmazását mutatjuk be. Az 1. példa megfelelő helyein utalunk bizonyos eljárási különbségekre - a termelő táptalajjal kapcsolatban -, valamint az ATCC 31683 alkalmazási körülményeire. A találmány szerinti eljárást tehát a következő példákkal szemléltetjük. 1. példa A) Rázott lombikos kísérletek Az Actinoplanes missouriensis micélium-fragmentumait - ezt a mikroorganizmust egyszerűség kedvéért a következőkben az ATCC 31682 törzs jelképezi - ferde tápagarra visszük át, amelynek összetétele a következő: Komponens Mennyiség, % cerelóz 0,5 burgonya-dextrin 2,0 Nutrisoy liszt+ 1,5 élesztőkivonat 0,25 CaC03 0,1 agar 2,0 + A nutrisoy lisztet az Archer Daniels Midland Company-tól (Decatur, Illinois) szerezhetjük be. Az ATCC 31682-vel beoltott ferde agart 6 napon át 30 °C-on inkubáljuk. A tenyészet nem képez spórákat, így a micélium-növekményt steril pipettával kell fellazítanunk. A lekapart érett tenyészetet steril desztillált vízzel fedjük le és a pipettával vagy egy steril pálcával alaposan eldörzsöljük micéliumszuszpenzió előállítására. Az így kapott szuszpenziót arra használjuk, hogy beoltsunk 100 ml steril vegetatív táptalajt, amely a következő összetételű: Komponens Mennyiség, % cerelóz 0,5 burgonya-dextrin 2,0 Nutrisoy liszt 1,5 élesztőkivonat 0,25 CaC03 0,1 Az inokulált vegetatív táptalajt 48 órán át tenyésztjük 30 °C-on, körrázógépen (250 ford./perc). A beoltott vegetatív tenyészet 10 ml-ével 100 ml, következő összetételű „ugrató” táptalajt oltunk be: Komponens Mennyiség, % cerelóz 0,5 élesztő 0,25 t 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
