189512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makrolid antibiotikumok előállítására
1 .189 512 . 2 törzset használunk, amely ezeket a vegyületeket termeli süllyesztett és levegőztetett fermentációs körülmények között, megfelelő összetételű táptalajban. A tenyésztést addig folytatjuk, míg jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel. A témában jártas szakember előtt nyilvánvaló, hogy először a DMT termelődik a fermentáció során. A dihidro-DMT akkor keletkezik, ha a fermentációt hosszabb időn át végezzük, amikor a jelenlévő DMT enzimatikusan redukálódik. A Streptomyces fradiae NRRL 12 170 mikroorganizmus tenyésztéséhez többféle táptalajt használhatunk. A termelés gazdaságossága, az optimális hozam és a termék izolálásának egyszerűsítése érdekében azonban bizonyos összetételű táptalajok előnyösek. így például szénforrásként előnyösen, különösen a nagy térfogatú fermentációkkor szénhidrátokat, például dextrint, glükózt, keményítőt, kukoricalisztet és olajokat, például szójabab-olajat használunk. Nitrogénforrásként előnyösen például kukoricalisztet, szójalisztet, hallisztet, aminosavakat, vagy más, hasonló készítményeket használunk. A táptalajhoz adott szervetlen sók például a vízben oldódó, vasionokra, káliumionokra, nátriumionokra, magnéziumionokra, kalciumionokra, ammóniumionokra, kloridionokra, karbonátionokra, szulfátionokra, nitrátionokra és más, hasonló ionokra disszociáló sók. A mikroorganizmus növekedéséhez és kifejlődéséhez szükséges nyomelemeket szintén hozzáadhatjuk a táptalajhoz. Ezek a nyomelemek általában szennyezőanyagként jelen vannak a táptalaj többi összetevőjében, mégpedig a mikroorganizmus igényének megfelelő mennyiségben. Esetenként kevés (például literenként 0,2 ml) habzásgátló szert, például polipropilén-glikolt (molekulasúlya körülbelül 2000) adunk a nagytérfogatú fermentációk táptalajához, abban az esetben, ha a habzás problémát okoz. Nagyobb mennyiségű DMT vagy dihidro-DMT előállításához tankfermentorban süllyesztett, levegőzteti körülmények között végzünk fermentációt. Kismennyiségű DMT-t vagy dihidro-DMT-t úgy állítunk elő, hogy rázott lombikban végzünk tenyésztést. Az antibiotikum termelésben mutatkozó lag-fázis miatt, amely általában akkor jelentkezik, ha nagymennyiségű táptalajt oltunk be a mikroorganizmus spóráival, előnyösen vegetatív inokulumot használunk. A vegetatív inokulum előállítására kismennyiségű táptalajt oltunk a mikroorganizmus spóráival vagy micélium darabkáival, ilyenkor friss, aktívan növekvő tenyészetet kapunk. A vegetatív inokulummal ezután beoltjuk a nagymennyiségű táptalajt. A vegetatív inokulum előállítására használt táptalaj a főfermentációs táptalajjal azonos lehet, használhatunk azonban más összetételű táptalajt is. A S. fradiae NRRL 12 170 mikroorganizmust 10 °C és 37 °C közötti hőmérsékleten növeszthetjük. Az antibiotikum termelés szempontjából optimális a 28 °C. Ahogy az a levegőztetett, sülyesztett fermentációknál szokásos, a táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A nagymennyiségű antibiotikum termelés érdekében tankfermentációkor 28 °C hőmérsékleten és 1 atmoszféra nyomáson 30%-os, vagy ennél magasabb levegő-telítettséget biztosítunk. A fermentáció során az antibiotikum termelést oly módon követjük, hogy mintákat az antibiotikumokra érzékeny mikroorganizmussal szemben mérünk. Mérőorganizmusként például Staphylococcus aureus ATCC 9144 mikroorganizmust használunk. A biológiai értékmérést előnyösen automatizált turbidimetriás módszerrel végezzük. Az antibiotikum termelést ezen kívül követhetjük nagyfelbontású folyadék-kromatográfiával UV fényben. A süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között kivitelezett tenyésztés után a DMT-t vagy a dihidro-DMT-t a fermentációs szakmában ismert módszerekkel különítjük el a tenyészléből. A DMT vagy a dihidro-DMT kinyerésére szűrjük a tenyészlevet. A szűrt levet ezután tovább tisztíthatjuk az előállítandó antibiotikum kinyerésére. A tisztítás során több módszert használhatunk. A szűrt lé tisztítása például oly módon történhet, hogy pH-ját 9-re állítjuk be, megfelelő oldószerrel, például etil-acetáttal, amil-acetáttal vagy metilizobutil-ketonnal extraháljuk, a szerves fázist elkülönítjük és vizes, savas oldattal extraháljuk. Ezt követően kicsapjuk az antibiotikumot oly módon, hogy a vizes extrakt pH-ját lúgosra állítjuk be. A további tisztitási lépéseket extrakcióval, adszorpcióval és/vagy kicsapással végezzük. A találmány szerinti új mikroorganizmust a tilozint termelő Streptomyces fradiae kémiai mutagenezisével állítottuk elő. A mutagenizált mikroorganizmus csak kismennyiségű tilozint termel, termeli viszont a DMT-t, mégpedig major komponensként. Jellemzés céljából az új mikroorganizmust összehasonlítottuk a Streptomyces fradiae M48-E 2724.1 törzzsel, ez a törzs a S. fradiae NRRL 2702 mikroorganizmusból származik, és tilozint bioszintetizál. A S. fradiae NRRL 2702 mikroorganizmust Hamill és munkatársai írják le a 3 178 341 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. A jelen leírásban a tilozint termelő S. fradiae M48-E 2727.1 tenyészetet E2724.1 törzsnek nevezzük. Az új DMT- és dihidro-DMT-t termelő NRRL 12 170 törzset szintén Streptomyces fradiae-nek határoztuk meg. A meghatározás során az International Streptomyces Project Streptomyces fajokra érvényes módszereit használtuk [Shirling és Gottlieb, Methods For Characterization of Streptomyces Species; Internal. Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3), 313-340 (1966)]; a vizsgálat során bizonyos kiegészítő vizsgálatokat is végeztünk. Az összehasonlítást az alábbi S. fradiae mikroorganizmusra vonatkozó irodalom figyelembevételével végeztük: 1) Buchanan és Gibbons, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás. The Williams és Wilkins Co., Baltimore, Md., 1974, 815. oldal; és 2) Shirling és Gottlieb. Cooperative Description of Streptomyces. II. Species Description from First Study, Internal. Journal of Systematic Bacteriology, 18 (2), 118, 1968]. Az új törzs és az E2724.1 törzs spóraláncainak 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
