189407. lajstromszámú szabadalom • Eljárás poliferáló növényi sejtformációk előállítására
1 2 189 407 A találmány tárgya eljárás protoplasztokból (sejtek sejtfalon belüli állománya) képezett növényi sejtek termesztése illetve szaporítása agaróz-táptalaj alkalmazásával. A fold népességének gyors növekedésére való 5 tekintettel a biológiai kutatások egyik súlypontját az értékesithető növények tenyésztése képezi. Egyrészről alternatív, reprodukálható élelmiszer-, energia- és nyersanyagforrások, mint például előnyös tulajdonságokkal, például betegség-kór- 0 okozókat (mint növénypusztitó rovarok, gombák, baktériumok, vírusok és hasonlók), továbbá időjárási vagy helyi hatások (mint hőség, hideg, szél, talajminőség, nedvesség, szárazság és mások) iránt fokozott ellenállóképességgel rendelkező, vagy a 5 levelekben, magokban, gumókban, gyökerekben, szárakban és hasonlókban fokozott tartalék- és készletképzésre képes új növény-, különösen hibrídfajták után kutatnak. Másrészről az értékes biomasszák iránti kereslet mellett fokozódik a gyógyszerészetileg hasznosítható növényi hatóanyagokkal és ezek származékaival, mint például alkaloidokkal, szteroidokkal és hasonlókkal szembeni kereslet, amelyeket természetes előfordulású anyagokból való alacsony kitermelésük miatt egyre in- 25 kább alternatív úton, például génmanipulált növényfajtákból tesznek hozzáférhetővé. Ezért fokozódó érdeklődés mutatkozik számos növényfajta célzott génmanipulációjának gyakorlati lehetőségeivel szemben. ;*0 Mint ismeretes, magasabbrendú növények izolált, totipotens sejtjei polimertartalmú táptalajokon (vagy táptalajokban) embrionális sejtformáció kialakítására és egyes esetekben élet- és szaporodóképes növények létrehozására késztethetők. Mivel 15 azonban a viszonylag szilárd sejtfalak általában áthidalhatatlan gátat képeznek a manipulációk, mint sejtfúziók vagy génátültetések számára, ilyen esetekben előnyösen a csupasz protoplasztokat használják, melyek a sejtfalak önmagában ismert 40 módon való eltávolítása útján, például enzimek (pektinázok, cellulázok és mások) segítségével a megfelelő totipotens, ép sejtekből állíthatók elő. Növényi sejtek és különösen protoplasztok táptalajához gélképző anyagként eddig szokásosan 45 agart használtak. Megállapítható azonban, hogy az agar a legtöbb protoplasztfajtára nézve mérgező és csak néhány kivételes eset ismeretes, amikor különlegesen ellenállóképes protoplasztok agarban eredményesen tenyészthetők. 60 Ezért az utóbbi időben kutatások kezdődtek el más, előnyös táptalajok iránt. Egyebek között megállapították, hogy az alginát és az agar azonos értékű tenyésztési tulajdonságokkal rendelkezik (Adaoha-Mbanaso È. N., Roscoe D. H., Plant Sei. 65 25, 61-66 (1982)). Agarózt eddig kizárólag állati sejtek tenyésztéséhez és mikroorganizmusok szaporításához alkalmaztak. Növényi sejtek tenyésztésénél azonban a teljesen eltérő fiziológia miatt egészen más problé- eo makörrel állunk szemben. Az állati sejtek szaporítási módszerei növényi sejtek szaporítására kényszerűen nem vihetők át, éppoly kevéssé, mint növényi formációknak protoplasztokból való előállítására. 55 A találmány célkitűzése ezért azoknak a nehézségeknek a leküzdése, melyek növényi protoplasztokból nyert sejtkultúrák agaron vagy tisztított agaron való tenyésztésénél fellépnek, és nemcsak különösen erőteljes, hanem minden protoplasztfajtára általánosan alkalmazható eljárás kidolgozása, melynek során sejtformációk illetve embrionális növények tenyésztése a tápközeg növénymérgező hatásának elkerülése mellett egyszerű, a gyakorlatnak megfelelő módon lehetséges. E feladatot a találmány szerint meglepő módon oldottuk meg. Az agar egyik alkotórésze az agaróz. A kereskedésbeli agar ugyanis főleg semleges agaróz és nagyszámú kötött oldalcsoportot tartalmazó ionos agaropektin keverékéből áll. A szokványos minőségű agarózt általánosan ismert módszerekkel agárból állítják elő. Általában visszamarad néhány oldalcsoport, melyek alapvetően meghatározzák a fizikokémiai tulajdonságokat, mint a gélképződést és a gélesedési és olvadási hőmérsékletet. , Alacsony hőmérsékleteken olvadó és gélesedő agaróz például úgy állítható elő, hogy az agarózmolekulába utólag hidroxi-etil-csoportokat visznek be. Az így módosított agarózt itt és az alábbiakban LMT-agaróznak („low melting agarose”) nevezzük. Meglepő módon azt találtuk, hogy a protoplasztokból képződött növényi sejtek agarban való szaporításánál fellépő nehézségek - különösen a protoplasztok nagyfokú pusztulása - lényegesen csökkenthetők, ha agar helyett agarózt használunk. A protoplasztokból nyert sejtek szaporodása még tovább fokozható, ha nemcsak agarózzal, különösen LMT-agarózzal szilárdított táptalajt használunk, hanem a protoplasztokkal beoltott táptalajt még kisebb szegmensekre is felosztjuk és ezeket a szegmenseket egyesével vagy csoportosan tápoldatban inkubáljuk kívánt nagyságú sejtformációk képződéséig. Egyáltalában nem volt előrelátható, hogy a tetszőleges eredetű agaróz a különféle protoplasztfajták - különösen az érzékeny protoplasztfajták - sejttenyészeteinek képződési készségét olyan döntően képes fokozni, hogy eddig nem tenyészthető protoplasztfajták is most már sejtformációk, sőt egész növények képzésére késztethetők. A találmány tárgya eljárás proliferáló (szaporodó) sejtformációk előállítására, mely szerint (a) izolált protoplasztokat, vagy izolált, protoplasztokból regenerált sejteket agarózzal szilárdított tápközegben (vagy tápközegen) egyenletesen szétoszlatunk, és/vagy (b) ezt az előkezelt és gélesített táptalajt felaprítjuk, a kapott szegmenseket tápfolyadékba helyezzük, és a tenyészetet mindkét esetben a sejtformációk kívánt nagyságának eléréséig folytatjuk. Sejtformáció alatt áttekinthető (számlálható) mennyiségű növényi sejtekből vagy kész növényekből álló tenyészetek értendők. Különösen előnyben részesítjük a proliferáló növényi sejtformációk előállítására szolgáló eljárást, mely szerint (a) izolált protoplasztokat vagy izolált, protoplasztokból regenerált sejteket agarózzal gélesített tápközeg(b)en egyenletesen szétoszlatunk, vagy (b) ezt az előkezelt és gélesített táptalajt felaprítjuk, a szegmenseket 1-10 000-szeres, előnyösen 2
