189286. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejt- és szövetregeneráló anyagok előállítására
1 189 286 2 Ismeretes, hogy emlős állatok szerveiben és testnedveiben előforduló, illetve onnan extrahálható bizonyos vegyületek a sebek gyógyulását meggyorsító hatással rendelkeznek (81 102 848.9 sz., 0 038 511 számon nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés). Az idézett nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés szerint az extrahált hatóanyagok szerkezetük alapján elsősorban a glikoszteroidok és glikoszfingolipidek csoportjába sorolhatók. A glikoszteroidok az (I) általános képletnek felelnek meg. A képletben R jelentése 5 cukoregységből álló oligoszacharid. A glikoszfingolipid a (II) általános képletnek felel meg. A képletben R jelentése 5 cukoregységből álló oligoszacharid. A fenti vegyületek különböző szervekből (pl. szív, tüdő, izmok, lép, testnedvek, mint pl. vér, plazma és szérum) izolálhatok. A fenti vegyületek kinyerésére alkalmas emlősök közül az embert, sertést, lovat és birkát említjük meg. Az idézett európai szabadalmi bejelentés szerinti eljárás során az alábbi lépéseket alkalmazzák ; aktivszénen történő abszorpció (affinitás-kromatográfia) és 10-30%-os ecetsavval végzett extrakció, molekulaszitán történő második kromatografálás és híg ecetsavas eluálás, kovasavgélen végzett harmadik kromatografálás és etanolnak metilénkloriddal képezett elegyével történő eluálás, illetve Cg-szénlánccal bevont kovasavgélen történő eluálás és ecetsav, etanol és víz elegyével végrehajtott eluálás. Meglepő módon azt találtuk, hogy a fentiekben felsorolt kiindulási anyagokból a sejt- és szövetregeneráló tulajdonságokkal rendelkező glikolipidek lényegesen magasabb kitermeléssel nyerhetők ki oly módon, hogy a kiindulási anyagokat előbb alkoholos-vizes közeggel szemben autolízisnek és dialízisnek vetjük alá. Ily módon a kívánt hatóanyagokat az ismert eljárás termékéhez viszonyítva előre nem látható módon, rendkívül nagy mértékben feldúsítva tartalmazó nyersterméket kapunk. A találmányunk szerinti eljárás kidolgozása során továbbá azt találtuk, hogy a fentiekben említett glikoszteroidok a gyógyászati felhasználás követelményeit nem kielégítő kismértékű stabilitással rendelkeznek. Azt találtuk továbbá, hogy a kapott nyerstermékből a glikolipideket lényegesen egyszerűbben izolálhatjuk oly módon, hogy AJ etanolos oldatból alacsonyabb hőmérsékleten - pl. - 20 °C körüli hőmérsékleten - kicsapjuk; vagy B) vízzel nem vagy csupán korlátozottan elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk; és az A), illetve B) lépésnél kapott terméket kovasavgélen vagy ioncserélőn kevéssé poláros oldószerrel kromatografáljuk. A kromatográfiás szétválasztások közismerten költséges volta miatt lényeges előny, hogy a találmányunk szerinti eljárásnál csupán egyetlen kromatográfiás lépésre van szükség és a találmányunk szerinti eljárásnak az ismert módszerekhez viszonyított fenti előnye különösen ipari körülmények között történő megvalósitás esetében jelentős. A találmányunk szerinti eljárás ipari megvalósításának további előnye, hogy az autolízis és dialízis fontosabb lépései egyidejűleg és folyamatosan, ellenáramú eljárással végezhetők el. A találmányunk tárgyát képező eljárást az jellemzi, hogy a vért vagy szervhomogenizátumot alkoholos-vizes közeggel szemben autolízisnek és dialízisnek vetjük alá. Az alábbiakban találmányunk részleteit ismertetjük. Kiindulási anyagként előnyösen emlősök fibrinmentesített vérét és szervhomogenizátumát - pl. szarvasmarha- vagy borjúvért, különösen előnyösen borjúvért - alkalmazhatunk. A kiindulási anyagot - mint már említettük - előbb autolízisnek vetjük alá, és az autolizátumot dializáljuk. Az autolízisnél képződő anyag feloldódásának biztosítása céljából előnyösen oly módon járhatunk el, hogy a kiindulási anyagot rövidszénláncú alkohollal (előnyösen 10-30% koncentrációban metanollal vagy etanollal) és valamely bakteriosztatikummal (előnyösen 0,1-0,0001% koncentrációban 4-hidroxi-benzoesav-metiIészterrel vagy 4-hidroxi-benzoesav-propilészterrel) elegyítjük. Az autolízist oly módon végezhetjük el, hogy a kiindulási anyagot néhány óra és néhány nap közötti időtartamon át (pl. 3 napig) 4 °C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten állni hagyjuk. A két műveletet azonban előnyösen egyidejűleg és folyamatosan ellenáramban végezhetjük el, minthogy az autolizált terméknek a kiindulási anyag oldalán történő folyamatos elvétele az egyensúlyt állandóan az autolízis-reakció irányában tolja el. Az autolízis alatt az intracelluláris katabolikus enzimek (pl. liposzómák, mint pl. katepszin és más proteázok, továbbá nukleotidázok, észterázok, foszfatázok, stb.) felszabadulnak. A dialízis során az anyagok - közöttük a kívánt glikolipidek - molekulasúlya 10 000 alatti érték. A dialízis tehát egyrészről meggyorsítja az autolizist, másrészről eltávolítja a gyógyászati felhasználás során allergiás reakciók előidézésére képes fehérjéket. A dialízis alatt az anyagok felvételére szolgáló közegként víz és kis szénatomszámú alifás alkoholok (pl. metanol és etanol) elegyét alkalmazhatjuk. Előnyösen alkalmazhatunk vízből és 10-30 térfogat% etanolból - különösen vízből és 15 térfogat% etanolból - álló oldószer-elegyeket. A nyers terméket adott esetben a soron következő izolálási és szétválasztási lépések időtartamára átmenetileg megvédhetjük. A megvédést a peptidkémiából hasonló célra ismert védőcsoportokkal végezhetjük el. A védőcsoportok szelektív bevitelével a hatóanyagok funkcionális csoportjait blokkoljuk és a hatóanyagokat a reakcióelegyből történő extrakció szempontjából előnyösebb formává alakítjuk. Az izolálás és tisztítás után a védőcsoportokat lehasítjuk. Az alábbi védőcsoportokat és lehasítási módszereket alkalmazhatjuk előnyösen: Benzoilcsoport (lehasítás híg lúggal); benziloxi-karbonil-csoport (lehasítás brómhidrogénsavval jégecetben, trifluorecetsavban vagy más szerves oldószerekben; sósavval etanolban; trifluorecetsavval melegen vagy fémnátriummal folyékony ammóniában); 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
