189246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy enzim és egy antitest kovalens kötés útján létrehozott új konjugátumainak előállítására
1 189 246 2 Az - S - S - X gyök aktivált kevert diszulfidot jelent, amely reagálni képes szabad tiol-gyökkel. Ebben a kevert diszulfidban X főleg 2-piridi! vagy 4-piridil-csoportot jelent, amelyek egy vagy több alkil, halogén vagy karboxil-gyökkel lehetnek helyettesítve. X jelenthet fenil-csoportot, amely előnyösen egy vagy több nitro- vagy karboxil-csoporttal van helyettesítve. X továbbá jelenthet alkoxikarbonil-csoportot is, pl. metoxikarbonil-csoportot. Az R gyök bármilyen olyan gyököt jelenthet, amely egyszerre képes hordozni az Y és az — S —S —X szubsztituenseket. Ezt úgy kell kiválasztani, hogy ne tartalmazzon olyan csoportokat, amelyek a későbbi reakciók folyamán alkalmazott reagensekkel vagy a szintetizált termékekkel reakcióba lépve zavart okoznának. Az R csoport főleg — (CH2)n csoport lehet, ahol n 1 és 10 közti egész szám, vagy egy R3—CH — CH I r4 csoport, amelyben R4 jelentése hidrogénatom vagy 1-8 szénatomszámú alkil-csoport és R3 olyan szubsztituens, amely a további reakciókhoz szükséges reagensekhez közömbös (pl. karbamát-csoport, NH— C—OR5 II O ahol Rs 1-5 szénatomos, egyenes vagy elágazó szénláncú alkilcsoport, elsősorban tere. butilcsoport). Az Y —R —S —S —X vegyület reakcióját a P2 fehérjével homogén folyadék-fázisban hajtjuk végre, leggyakrabban vízben vagy puffer-oldatban. Amikor a reagens oldhatósága ezt megköveteli, lehetséges a reakcióközeghez vízzel elegyedő szerves oldószert, pl. valamilyen alkoholt, főleg tercier butanolt adni 20 tf % mennyiségig. A reakciót szobahőmérsékleten hajtjuk végre, a reakció időtartama néhány óra és 24 óra közt változhat. Ez után a dialízis teszi lehetővé, hogy a kis molekulasúlyú termékeket és a reagensek fölöslegét eltávolítsuk. Ez a folyamat teszi lehetővé nagy számú szubsztituens bevezetését egy mól fehérjébe, ez a szám általában 1 és 15 között van. Ilyen vegyületeket használva a kapcsolás a Px fehérjével megtörténik a két fehérje vizes oldatának összehozásával 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten, a reakció időtartama néhány órától egy napig terjedhet. A nyert oldatot dializáljuk a kis molekulasúlyú termékek eltávolítása érdekében, majd a konjugátumot különböző ismert módszerekkel tisztítjuk. 2. Tioéter-kötés A konjugátum készítése abban áll, hogy Px — SH-t reagáltatunk P2 fehérjével, amelybe előzőleg maleimid-csoportot vezettünk be. A reakciót az 1. reakcióvázlat szemlélteti; a reakcióvázlatban, az (I) és (II) általános képletben Z jelentése fenil- vagy naftilcsoport mint térkitöltő csoport. A maleimiddel szubsztituált P2 fehérjét ((I) általános képlet) magából a P2 fehérjéből nyerjük, a fehérje amino-csoportjait valamely maleimidcsoportot hordozó reagens segítségével szubsztituálva. A folyamatot a 2. reakcióvázlat szemlélteti, a reakcióvázlatban a (III) általános képletben Y, jelentése a következő lehet:- vagy karboxil-csoport, az ezzel kivitelezett reakció a karboxil-csoport aktiválásával történik egy kötő-ágens, mint pl. karbodiimid, és elsősorban ennek vízoldható származékai, pl. l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)karbodiimid, jelenlétében,- vagy egy ún. „aktivált észter”, mint pl. egy orto- vagy para-, nitro- vagy dinitro-fenil-észter, vagy egy N-hidroxiszukcinimid-észter, amely közvetlenül képes reagálni az amino-csoportokkal, acilezve azokat. Az ilyen reagensek készítését írja le pl. a Helvetica Chimica Acta 58, 521-541 (1975) irodalmi hely. Ugyanilyen típusú reagensek rendelkezésre állnak a kereskedelemben is. A (III) általános képletű vegyület reakciója a P2 fehérjével homogén folyadékfázisban történik, leginkább vízben vagy pufferoldatban. Amikor a reagensek oldhatósága ezt szükségessé teszi, a reakcióközegben 20 térfogat %-ig lehet vízzel elegyedő oldószert adni, mint pl. alkoholt, elsősorban tercier butanolt. A reakciót szobahőmérsékleten hajtjuk végre, a reakció időtartama néhány óra és 24 óra közt változhat. Ez után a dialízis teszi lehetővé, hogy a kis molekulasúlyú termékeket és főleg a reagensek feleslegét eltávolítsuk. Ezeknek a folyamatoknak a segítségével nagyszámú szubsztituenst vezethetünk be egy mól fehérjébe, ez a szám általában 1 és 15 között van. Ilyen vegyületeket használva a kapcsolás a P, fehérjével megtörténik a két fehérje vizes oldatának összehozásával 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten, a reakció időtartama néhány órától egy napig terjedhet. A nyert oldatot dializáljuk a kis molekulasúlyú termékek eltávolítása érdekében, majd a konjugátumot különböző ismert módszerekkel tisztítjuk. Ilyen immuno-enzim konjugátumot bármilyen enzimmel lehet készíteni. Gyógyászati alkalmazása azonban, amelyre ezeket a konjugátumokat szánjuk, és amelyet ez után leírunk, az előnyös enzimek azok, amelyek képesek ammónium-ionokat felszabadítani természetes szubsztrátumokból, és amelyeket a felnőtt állati szervezetek jól tűrnek. A nemzetközi osztályozás szerint, amely pl. a „Comprehensive Biochemistry” (Általános Biokéin'a) 13. kötet, 3. kiadásában (M. Florkin; E. H. Stortz, Elsevier, 1973) jelent meg, a gyógyászatilag alkalmas enzimek, amelyek a találmányban is szerepelnek, főleg a következő csoportokban találhatók:- az 1. csoportban (oxido-reduktázok) és főleg az 14 alcsoportban, amely az aminosav-dehidrogenázokat és az aminooxidázokat tartalmazza,- a 3. csoportban (hidrolázok) és főleg a 3-5 alcsoportba, amely az amidokat, amidineket és más C — N kötéseket (beleértve a peptid-kötéseket is) hidrolizáló enzimeket tartalmazza,- a 4. csoportban (liázok) és főleg a 4-2 és 4-3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
