189204. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátészter és sói előállítására
1 _ 189 204 2 1. példa 10 g (23,3 mmól) benzil-oxi-karbonil-L-tirozilterc-butil-oxi-karbonil-hidrazidot 100 ml száraz piridinben oldunk 0°C-on keverés közben, majd 5 11,0 g (50 mmól) acetil-kénsav-piridiniumsót adunk hozzá. A reakcióelegyet két napig szobahőn keverjük, bepároljuk, s a maradékot vízben felvéve a pH-t 7,5-re állítjuk 2 n nátrium-hidroxid-oldattal. Az oldatot éterrel extraháljuk, majd a vizes fázist 10 szárazra pároljuk. Az amorf maradékot acetonban oldjuk, a nem oldódó részt kiszűrjük, az acetont vákuumban szárazra pároljuk, az olajos anyagot éterrel kristállyá dörzsöljük. A nyert termék 9,2 g (67%) benzil-oxi-karbonil-O-szulfáto-L-tirozin- 15 terc-butil-oxi-karbonil-hidrazid-nátriumsó, erősen higroszkópos, Rj = 0,35 (retenciós kromatográfiai érték). 9,2 g benzil-oxi-karbonil-O-szulfáto-L-tirozil- 2Q terc-butil-oxi-karbonil-hidrazid-nátriumsót 100 ml etanolban oldunk és 1 g 10%-os Pd-C katalizátorral hidrogénezzük 10-20 órán keresztül, ezután a katalizátort kiszűrjük, a szűrletet vákuumban bepároljuk, a maradékot éterrel kristállyá dörzsöljük. ^ A termék 6,2 g (90%) O-szulfáto-L-tirozin-tercbutil-oxi-karbonil-hidrazid higroszkópos kristály R? = 0,71. 400 mg (1 mmól) O-szulfáto-L-tirozil terc-butiloxi-karbonil-hidrazid-nátriumsót és 4,13 mg 30 (1 mmól) fluorenil-metil-oxi-karbonil-L-aszparaginsav-P-terc-butil-észtert 5 ml dimetil-formamidban oldunk és az oldatot lehűtjük 0°C-ra, majd keverés közben 210 mg (1 mmól) dicikíohexilkarbodiimidet adunk hozzá. A reakcióelegyet egy 35 éjjel állni hagyjuk, majd 100 pl ecetsavat adunk hozzá. A kivált diciklohexil-karbamidot szűrjük, a szűrletet bepároljuk. A kapott olajos maradékot éterrel kristállyá dörzsöljük. A termék 536 mg (66%) fluorenil-metil-oxi-karbonil-L-aszparaginilß-terc-butil-O-szulfäto-L-tirozin-terc-butil-oxikarbonil-hidrazid-nátriumsó higroszkópos kristály. RJ = 0,2; Rf = 0,5. 1.4 g védett dipeptid-szulfátészter-nátriumsót 8 ml trifluor-ecetsavban oldunk 0°C-on keverés ig közben. Az oldatot 40 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a dipeptid-trifluor-acetátot száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük, éterrel mossuk, exszikkátorban szárítjuk. 1,3 g (95%) fluorenil-metiloxi-karbonil-L-aszparaginil-O-szulfáto-L-tirozil- gQ hidrazid-trifluor-acetát-nátriumsót (higroszkópos kristály) nyerünk. R^ = 0,55. 1.5 g (2 mmól) fluorenil-metil-oxi-karbonil-L- aszparaginil-O-szulfáto-L-tirozil-hidrazid-trifluoracetát-nátriumsót 7,5 ml dimetil-formamidban oldunk. Az oldatot -15 °C-ra hűtjük keverés közben, majd 0,5 ml 5 mólos nátrium-nitrit-oldatot és 0,4 ml cc. sósavat adunk hozzá. A reakcióelegyet - 15 °C-on 15 percig kevertetjük, majd 0,8 ml trietil-aminnal semlegesítjük és 1,2 g (1,3 mmól) qq L-metionil-glicil-L-triptofil-L-metionil-L-aszparaginil-L-fenilalanin-trifluor-acetátot adunk hozzá, 5 ml dimetil-formamidban oldva. Az oldat pH-ját 24 órán át trietil-aminnal 7,0-n, a hőmérsékletet + 4 °C-on tartjuk, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékleten még egy éjjelen át állni hagyjuk. Az oldat pH-ját 6,0-ra állítva vákuumban bepároljuk, a maradékot 30 ml 1 n sósavval kezeljük. A kapott amorf port szűrjük, vízzel, éterrel mossuk, majd 30 ml dimetil-formamid és 5 ml víz elegyében oldjuk. A pH-t 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátoldattal 7,0-re állítjuk, majd bepároljuk. A kapott 3,7 g anyagot 10 ml vizes piridin-acetátban (piridin : ecetsav : víz 20 : 6 : 11) oldjuk, az oktapeptidnátriumsót 90 ml etil-acetáttal kicsapjuk, szűrjük és etil-acetáttal mossuk. A 2 g ( 1,2 mmól) (IV) általános képletű védett oktapeptid-nátriumsót 15 ml dimetil-formamidban oldjuk, 300 pl (3 mmól) piperidint adunk hozzá. 10 perc után az oldatot 250 pl ecetsávval semlegesítjük, bepároljuk, a szabad oktapeptid-szulfátésztert 0 °C-on 10-15 ml 1 n sósavval kicsapjuk, szűrjük, vízzel mossuk. A nyert amorf port 15 ml dimetil-formamid és 5 ml metanol elegyében oldjuk, a pH-t 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal 7,0-re állítjuk és szárazra pároljuk. Etil-acetáttal eldörzsölve 1,4 g amorf anyagot kapunk, amelyet az 5. oldószer rendszerben szilikagél-oszlopon kromatografálunk. A megfelelő frakciók egyesítése és bepárlása után 860 mg tiszta (I) képletü L-aszparaginil-O-szulfáto-L-tirozil-L-metionil-glicil-L-triptofil-L-metionil-L- aszparaginil-L-fenilalanin-amid-nátriumsót kapunk. A termelés 57%, R* = 0,33 [a]^ = - 23,0° (c= 1, DMF). 2. példa Az 1. példa szerint előállítjuk az N-terminálison fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoporttal védett kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátésztert és a fluorenilmetil-oxi-karbonil-csoportot piperidinnel lehasítjuk. A szabad oktapeptid-szulfátésztert (2 g; 1,3 mmól) 0 °C-on 1 n sósavval kicsapjuk, szűrjük, vízzel mossuk. A kapott amorf szilárd anyagot 15 ml dimetil-formamid és 5 ml metanol elegyében oldjuk, a pH-t 5% kálium-hidrogén-karbonátoldattal 7,0-re állítjuk, az anyagot szárazra pároljuk. Az oktapeptidet az 1. példában ismertetett módon tisztítjuk. 900 mg (59%) tiszta L-aszparaginil-O-szulfáto-L-tirozil-L-metionil-glicil-L-triptofil-L-metionil-L-aszparaginil-L-fenil-alanin-amidtrikáliumsót kapunk. R® = 0,33. [a]£> = -22,6° (c = 1, DMF). 3. példa 2 g (5 mmól) fluorenil-metil-oxi-karbonii-L-tirozint 5 ml kloroformban oldunk, lehűtjük - 15 °C- ra, hozzáadunk 550 pl N-metil-morfolint és 650 pl klór-hangyasav-izobutil-észtert. Tíz perc keverés után 0,65 g (5 mmól) terc-butil-oxi-karbonil-hidrazidot adunk hozzá, egy éjjel hűtőben állni hagyjuk. A kivált kristályokat szűrjük, a szűrletet bepároljuk, etil-acetátban feloldjuk, majd kálium-hidrogén-szulfát és kálium-hidrogén-ícarbonát-oldattal extraháljuk. Az etil-acetátos oldatot vízmentes nátrium-szulfáton megszárítjuk, bepároljuk, 10 ml piridinben feloldjuk és az 1. példában megadott mó-4
