188973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriofágoknak vízből való kimutatására a koncentrálásra használt adszorpciós szűrő felületén
1 188973 2 A találmány tárgya bakteriofág diagnosztikai eljárás, melynek során az adszorpciós sajátságokkal rendelkező membránszűrőn, mélységi szűrőn vagy egyéb szűrőanyagon megkötött bakteriofágokat hagyományos értelemben vett elució nélkül, a szűrőnek az utólag rárétegzett mikroorganizmus indikátorral együtt, a tápanyagokat, szénforrást és a deszorpciót elősegítő anyagokat /ásványi sók, peptidek és detergensek/ tartalmazó lágyagar lemezen történő 16—24 órás inkubációja után vizuálisan észlelni lehet. A bakteriofágok /ivó/ vízből való kimutatásának higiénés értéke abban áll, hogy fertőtlenítő szerekkel szemben tanúsított rezisztenciájuk mértéke, valamint méretük hasonló a humán vírusokhoz, így amennyiben egy vízkezelési eljárás után a kezelt vízből bakteriofágokat lehet kimutatni, úgy ebben a vízben humán vírusok jelenléte sem zárható ki. / A bakteriofágok vizsgálata -tájékozódó jelleggel- azért előnyösebb, mert kimutatásuk rutin bakteriológiai technikával történik, szemben a humán városokkal, melyeknek kimutatásához különlegesen felszerelt laboratórium és drága anyagok szükségesek./ A szakirodalomban fellelhető adatok szerint,/20/—400 > liter ivóvíz bakteriofág vizsgálata szükséges a megfelelő higiénés értékeléséhez akkor, ha a kimutatás hatásfoka 100% /Ann. Rev. Microbiol. 1977. 33, 413-37./. Néhány korai próbálkozástól eltekintve / amikor is az adszorbeált vírusokat a membrán dezintegrálásával tették kimutathatóvá: Appl. Mikcrobiol. 1961. 9. 367 -79., Bull. World Health Org. 1967. 36. 219- —25./, az adszorbeált bakteriofágokat a szűrőanyagról magas pH—jú 19,0-11,5/, általában fehérjetartalmú eluenssel mossák le. Ennek az eluensnek a mennyisége a fágkimutatáshoz még túl nagy /60 ml, ha 90 mm átmérőjű Zêta Plus 50S jelű szűrőt használnak: Appl. Env. Microbiol. 1980. 39, 85—91., 293 mm átmérőjű cellulóz nitrát membránszűrő esetén 1000 ml: J. Am. Water Works. Assoc. 1972. 64. 189-96., Water Res. 1972. 6. 1249—56./. Mivel lágyagar—felülrétegzési technika alkalmazásakor a tesztelhető térfogat általában nem több 1 ml—nél, az eluens térfogatát megfelelő módon csökkentik. Ezt manapság általában dialízis felhasználásával hajtják végre. /Összefoglalóan: Ann. Rev. Microbiol. 1979. 33.413-37J Megállapítható, hogy az adszorpciós technika alkalmazása során az eluáló folyadék térfogatának csökkentése munka és eszköz—, valamint időigénye folytán az eljárást nagymértékben bonyululttá tette. Á találmány tárgya egy olyan eljárás, melynek alkalmazásával az adszorpciós tulajdonságokkal rendelkező szűrőanyagon megkötött bakteriofágok az előbbiekben ismertetett eluciós lépés nélkül mutatható ki. A módszer elvi alapja az a felismerés, hogy az adszorbensekhez kötött bakteriofágokat eluálni képes anyagok, illetve az adszorbens sajátoságokat megszüntetni képes detergensek / J. Appl. Bact. 1979. 46. 103— —16./ az indikátor baktériumok táptalajába keverhetőek. Ennek alapján olyan, agarral szilárdított, Petri csészébe kiöntött lemezeket készítettünk, melyek azon kívül, hogy biztosítják a rájuk helyezett szűrőre rétegzett indikátor baktériumok gyors növekedését, megfelelő komponensek révén, miközben ezek a tápkomponensekkel együtt a növekedő baktériumokhoz áramlanak, a membrénhoz kötött bakteriofágokat eluálják. 7 Az ilyen módon mobilizált fágok a baktériumokhoz jutnak és tarfoltot hoznak létre. A tarfoltok vizuális észlelésének elősegítésére a táptalaj olyan festéket tartalmaz, amely a bakteriális anyagcsere hatására markáns színváltozást szenved és ilyen formájában nem diffuzibilis._ Amennyiben a bakteriofágok jelenlétére vizsgált víz olyan mennyiségben tartalmaz szűrhető anyagot, hogy az adszorpcióhoz használt, általában 0,2-0,45 pm pórusátmérőjű szűrőt ez eltörni, illetve a szűrési sebességet jelentősen csökkenti, úgy nagyobb pórusátmérőjű szűrő, vagy szűrősorozat alkalmazásával előszűrést _ kell végezni. Amennyiben az előszűrő anyaga adszorpciós sajátságokkal rendelkezik, úgy fágok megköjtődésével ezeken is számolni kell. Az előbbiekben ismertetett módszer segítségével az előszűrőkhöz adszorbeált fágok is kimutathatók. A bakteriofágok vízből való adszorpciójára előnyösen membránszűrőket, vagy vékony mélységi szűrőket alkalmazhatunk, általában 0,2—o,65 gm pórusátmérővel. Előnyösen használhatók olyan szűrő típusok, melyeknek jelentős adszorpciós kapacitásuk van. A szűrő átmérője olyan, hogy azt egyszerűen lehessen agar lemezre helyezni, célszerűen 25-150 mm. Az adszorpciós folyamat pH-ja neutrális, vagy enyhén lúgos, előnyösen 6-8 között, melynél a bakteriofágok még nem károsodnak.Előszűrőként az adszorpcios szűrők nagyobb pórusátmérőjű változatai előnyösen alkalmazhatók. A szűrési folyamat befejezése után a szűrő anyagra indikátor baktérium friss, folyadékkultúrából származó tenyészetét kell rétegezői, előnyösen olyan mennyiségben, hogy a baktériumok a szűrő felületén egysejt réteget képezzenek. Ezután a szűrőt a baktérium sejtréteggel felfelé, buborékmentesen olyan agarlemezre helyezzük, amely a baktériumok növekedéséhez szükséges tápanyagokon kívül a fágok deszorpcióját elősegítő anyagot, vagy anyagkombinációt tartalmaz, célszerűen szervetlen sók, fehérje, illetve részleges fehéijehidrolizátum és detergensek, a neutrálisnál némileg magasabb, célszerűen 8-9 pH értéken. A táptalajnak a további lúgosodás megakadályozása érdekében puffer rendszert, vagy olyan szénforrást kell tartalmaznia, melyből ammónia nem szabadul fel, célszerűen szénhidrátot, vagy alkoholt. A táptalaj tartalmazza továbbá a tarfoltok észlelését megkönnyítő festéket, előnyösen tétrazolium származékot. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákban ismertetjük, megjegyezve, hogy a hatásfokot a szennyezéshez használt fágoldat hagyományos lágyagaros felületrétegezéssel kapott tarfoltszámával összehasonlítva kaptpk. ( Appl. Env. Microbiol. 1980. 39. 85-91.) 1. példa ’’ I ___ 10 liter, üvegről desztillált vizet 1 ml, 10—50T2 fágot tartalmazó fiziológiás konyhasó oldattal szennyeztünk és pH—ját 6,5-re állítottuk be. Ezután a vizet 0,45 pin pórusátmérőjű, 47 mm átmérőjű cellulóz-nitrát membránon szívattuk át vacuummal. A szűrési sebesség 0,65 liter/perc volt. A szűrés befejezése után Escherichia coli B törzs 3 órás folyadékkultúrájából /kb. 10y ind/ml 0,03 ml mennyiséget 500 ml ugyanilyen desztillált vízben clkeverve szívattunk a szűrőre. Ezután a szűrőt 16 g/1 tripton, 10g/l élesztőkivonat, 10 g/1 NaCl, 20 g/í glicerin, 20 g/1 beef extract /Difco/ és 7 g/1 agar tartalmú, pH 8 táptalajra helyeztük és 16 órán át 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
