188709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cedfalosporin-metilészterek enzimes dezészterezésére
1 188 709 2 azt megtöltjük a szilárd fázishoz kötött enzimmel, és a szubsztrát vizes oldatát vagy szuszpenzióját vezetjük át. Ha kevert tartályt használunk, úgy azt folyamatosan vagy szakaszonként használhatjuk, a gyakorlatból ismert módon. Amikor a szubsztrát vegyület érintkezésbe kerül az enzimmel, a szilárd fázishoz kötötten, vagy a nem-kötött enzimmel, megfelelő idő eltelte után megkapjuk a cefalosporinsavat. A savat ismert, szerves kémiai módszerekkel izoláljuk. Eljárhatunk például oly módon, hogy a terméket megfelelő sóvá alakítjuk, előnyösen terápiásán használható nátrium- vagy káliumsóvá, majd a vizet desztillációval eltávolítva, izoláljuk a terméket. A desztillációt csökkentett nyomású térben, és közepes hőmérséklet-tartományban végezzük. Úgy találtuk, hogy az észter-hasitási reakciót 7 és 9 pH-értéken, előnyösebben 7,5 és 8,5 közötti pH-n végezhetjük. A reakció optimális hőmérséklete 25 °C és 30 °C közé esik, alkalmazhatunk azonban 15 °C és 45 °C közötti hőmérsékletű reakcióelegyet is. Ahogy azt az előzőekben ismertettük, az enzim magasabb hőmérsékleteken nem különösebben stabil, így a fentiekben megadott hőmérsékleteken célszerű dolgoznunk. Az enzim Kn-értéke 2,3 mg/ml, a 7-amino-3-metil-3-cefém-4-karboxilál esetében; a szubsztrát koncentrációja a reakcióelegyben 1 mg és 10 mg/ml közé kell, hogy essen. Ügy találtuk, hogy az enzimet részlegesen tisztított alakban, fagyasztva vagy fagyasztva szárítva hosszú időn át tárolhatjuk. A fermentlevel, amelyben az enzimet előállítottuk, és a fermentléből izolált sejteket fagyasztva tárolhatjuk. Az alábbi példákban szemléltetjük az enzim előállítását S. capillispira mikroorganizmus fermentációjával, az enzim izolálását és tisztítását, továbbá az enzimmel végzett észter-hasítási reakciókat. A szubsztrátok és az észter-hasítási reakciók termékei ismert vegyületek, a termékek azonosításának bizonyítására szolgáló analitikai módszereket igy nem részletezzük. Éhelyett olyan analitikai módszerekkel mértük az észter-hasítási reakció lefolyását, amely lehetővé tette a reakcióelegyben lévő sav mennyiségének meghatározását. Egyes esetekben az analitikai módszer biológiai, más esetben kémiai titrálás végeztünk. A termék képződését ezen kívül autentikus cefalosporinsavakkal való kromatográfiás összehasonlítással is bizonyítottuk. Általában szűrőpapírral kivitelezett kromatográfiát végeztünk, oldószer-elegyként acetonitril és víz 4 : 1 arányú elegyét használva. Amikor a kromatográfia befejeződött, a papírlapot érzékeny mikroorganizmussal, általában Bacillus subtilisszel beoltott agar-lemezre helyeztük, majd a jelenlévő aktív antibiotikum-sav mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy a gátlási zóna nagyságát összehasonlítottuk hasonló rendszerben futtatott, ismert mennyiségű antibiotikum által okozott gátlási zóna nagyságával. Ha szubsztrát-észterként a 7-es helyzetben csak egy aminocsoportot tartalmazó cefalosporinésztert használtunk, úgy a keletkező sav mennyisége közvetlenül nem volt mérhető, mivel az alapsav nem aktív a teszt-organizmussal szemben. Ilyen esetekben egy acilezési reakciót végeztünk oly módon, hogy a futtatott kromatogramot acilezőszerrel permeteztük be. Acilezőszerként általában híg fenoxi-acetil-klorid-oldatot használtunk; ez az inaktív alapvegyületet aktív vegyületté alakítja át. Egy másik kimutatási módszer, az úgynevezett korong-módszer szerint eljárva, úgy végeztünk méréseket, hogy meghatározott mennyiségű, általában 10 pl analizálandó mintát pipettáztunk olyan szürőpapír-csíkra, amely lakkréteggel körülrajzolt zónákat tartalmazott; így a zónákba csepegtetett folyadékok egymástól elkülönültek. Ha a szubsztrál vegyület alap-észter, úgy acilezésre volt szükség. Az acilezési reakciót úgy végeztük, hogy a zónákba 10 pl, 2 %-os nátrium-bikarbonát-oldatot és 20 1, 2,5 %-os, petroléterrel készített fenoxi-acetil-klorid-oldatot csepegtettünk. Levegővel szárítottuk a korongokat, és a papírcsíkot B. subtilis mikroorganizmus spóra szuszpenziójával beoltott agar-mérőiemezre helyeztük. 45 percen át az agaron hagytuk a csíkokat, majd eltávolitottuk, és az agar-tenyészetet 25 °C hőmérsékleten inkubáltuk egy éjszakán át. Ezután mértük a gátlási zónák nagyságát, és a mintában lévő cefalosporinsav mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy észter-hasítási reakcióból származó cefalosporinsav ismert mennyisége áltállétrehozott gátlási zónák nagyságával hasonlítottuk össze. A fenti biológiai analitikai módszereket felhasználhatjuk nem-tisztított fermentációs elegyek és tisztított enzimkészítmények mérésére is. A tisztított készítményeket könnyen analizálhatjuk titrálással is, a titrálás során mérjük a jelenlevő sav mennyiségét. A mérést úgy végezzük, hogy meghatározzuk annak a bázisnak a mennyiségét, amely szükséges ahhoz, hogy a reakció során a reakcióelegy pH-ja állandó maradjon. így az észter-hasítási reakciót könnyen követhetjük például automatikus titrai óval. Úgy járunk el, hogy az enzim-készítményt megfelelő szubsztrát oldathoz adjuk, majd az észter-hasítási reakció követését úgy oldjuk meg, hogy automata titráló által a mintához adott bázis mennyiségét meghatározzuk. Az enzim-készítmények aktivitását az alábbi példákban bizonyos meghatározás alapján adjuk meg; ez a következő: az észter-hasított szubsztrátok móljainak száma/ mg fehérje vagy sejt x perc. Egyes esetekben az enzim aktivitását más módon írjuk le, ebben az esetben ezt részletesen magyarázzuk. Az enzim aktivitásának meghatározásához használt szubsztrát a metil - 7 - amino - 3 - metil - 3 - cefém - 4 - karboxilát, kivéve, ha másként adjuk meg. A szubsztrát észterek alkalikus körülmények között hidrolízissel spontán deésztereződnek. így nagyon fontos, hogy az enzim-készítmény aktivitásának mérésekor elkerüljük az alkalikus körülményeket, vagy figyelembe vegyük a nemznzimatikus hidrolízis mértékét. Az alábbi példák során általában kálium-hidro-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
